大鼠牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改良及生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、牙囊是包繞于成釉器及牙乳頭外周的一層疏松結(jié)締組織，起源于外胚間充質(zhì)，具有多向分化潛能，其通過上皮一間充質(zhì)反應(yīng)分化形成牙周膜、牙骨質(zhì)和固有牙槽骨。牙囊細(xì)胞以其較強(qiáng)的增殖分化能力成為牙周組織工程研究的一種種子細(xì)胞。 目前國內(nèi)對大鼠牙囊細(xì)胞的研究尚集中于體外培養(yǎng)方法的探索及生物學(xué)特性研究階段，本研究在國內(nèi)外學(xué)者研究的基礎(chǔ)上對大鼠牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立一種簡便、快速培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞的方法，并從膠原、骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)

2、等方面研究大鼠牙囊細(xì)胞的的生物學(xué)特性。 一、大鼠牙囊細(xì)胞分離、培養(yǎng)及傳代 本研究采用“牙囊直接剝離法”與“膠原酶、胰酶交替消化法”相結(jié)合的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的“兩步消化法”，即：無菌條件下直接從牙胚表面剝離牙囊組織，剪成1mm<'3>大小的組織塊，先用0.2％Ⅰ型膠原酶37℃水浴振動消化1小時，再加入0.25％胰蛋白酶繼續(xù)消化5分鐘(兩次加入的消化液體積比為3:1)，從而獲得細(xì)胞懸液，離心后加入含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液

3、，在含5％CO<,2>的37℃飽和濕度條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)。 通過這種方法，細(xì)胞懸液在12小時后，大部分細(xì)胞貼壁，原代培養(yǎng)6-7天長滿約80％，即可進(jìn)行傳代，而傳統(tǒng)方法則需2周時間，從而提高了效率。 細(xì)胞形態(tài)上呈非均質(zhì)性，存在多種細(xì)胞形態(tài)，其中以多角形和長梭形為多見，有兩個或多個樹突，具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，部分細(xì)胞胞漿中可見高密度顆粒的存在。 二、大鼠牙囊細(xì)胞的生物學(xué)特性分析 取

4、生長良好的第4代牙囊細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，通過細(xì)胞免疫組化染色，從波形蛋白、角蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)來分析大鼠牙囊細(xì)胞的生物學(xué)特性。 免疫組化染色結(jié)果顯示：波形蛋白表達(dá)陽性，呈棕黃色，定位于胞漿，細(xì)胞核則深染為藍(lán)色，而角蛋白表達(dá)陰性，除了細(xì)胞核為藍(lán)色外，胞漿不著色，證明細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)；Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，說明牙囊細(xì)胞具有成纖維特性；骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)也呈陽性，與活體組織原位雜交的實驗