胰島素抵抗大鼠存活時(shí)間與Klotho表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　 通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)當(dāng)日出生的Wistar大鼠建立胰島素抵抗(IR)模型,探討胰島素抵抗大鼠Klotho的表達(dá)變化與存活時(shí)間的關(guān)系以及川芎嗪(TMP)與氨基胍(AG)治療的干預(yù)作用。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:出生當(dāng)日Wistar大鼠,腹腔注射STZ(90mg/kg)復(fù)制IR模型(a model of noninsulin-dependent diabetes induced

2、by neonatal streptozotocin,n0-STZ)。正常伺養(yǎng)至8周齡,空腹血糖≥7.0mmnol/L或糖耐量試驗(yàn)餐后1小時(shí)血糖≥11.1mmol/L者選入本研究。設(shè)立正常對(duì)照組(CN組)、胰島素抵抗組(IR組)及川芎嗪+氨基胍(TMP+AG組)治療組。記錄各組大鼠存活時(shí)間。
　　 2.空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)和糖化血清蛋白(GSP)檢測(cè):分別于造模第8周、24周和32周斷尾取空腹血,檢測(cè)FPG

3、,留取血清檢測(cè)FINS和GSP,根據(jù)公式(FPG·FINS)/22.5計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)。采用果糖胺法檢測(cè)各組GSP含量。
　　 3.生化指標(biāo)檢測(cè):于造模32周,摘眼球取血,離心留取血清,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。留取肝、腎、腦等標(biāo)本。
　　 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR:分別檢測(cè)腎組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、IGF-1R和klotho

4、 mRNA,腦組織IGF-1R和klotho mRNA,肝組織IGF-1R mRNA的表達(dá)水平。
　　 5.Western Blot:檢測(cè)腎和腦組織Klotho蛋白、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)及IGF-1R表達(dá),肝組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)及IGF-1R的表達(dá)
　　 6.免疫組織化學(xué)染色:觀察腎組織klotho蛋白、磷酸化的胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:

5、　　 1.各組動(dòng)物32周齡存活率:IR組為35％(7/20),TMP+AG組85％(17/20),CN組為100％(20/20)。IR組存活率明顯低于CN組(P＜0.05),TMP+AG組存活率均明顯高于IR組(P＜0.05)。
　　 2.FPG、FINS和GSP檢測(cè)結(jié)果:8周齡時(shí),模型組FPG、FINS、IRI和GSP含量均高于CN組(JP＜0.05)。用藥8周(16周齡)時(shí),TMP+AG組FPG、FINS、IRI和GSP均

6、低于IR組(P＜0.05),高于CN組(P＜0.05);用藥24周(32周齡),TMP+AG組FPG和FINS較IR組進(jìn)一步降低(P＜0.05),FINS和IRI仍高于CN組;TMP+AG組與CN組間GSP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:各組血清TG、TC和Cr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TMP+AG組的BUN較IR組明顯下降(P＜0.05)。
　　 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果:
　　 (1)腎組織RAG

7、E mRNA表達(dá):IR組顯著高于CN組(P＜0.05)。TMP+AG組明顯低于IR組(P＜0.05),與CN組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)IGF-1R mRNA表達(dá):IR組腦、肝、外周血淋巴細(xì)胞較CN組明顯降低(P＜0.05)。TMP+AG組腦、肝組織較IR組明顯升高(P＜0.05),外周血淋巴細(xì)胞較IR組降低(P＜0.05);CN組、IR組和TMP+AG組間腎組織表達(dá)均無(wú)明顯差異。
　　 (3)Klotho mRN

8、A表達(dá):IR組腎、腦、外周血淋巴細(xì)胞較CN組明顯降低(P＜0.05)。TMP+AG組腎、腦組織較IR組明顯升高(P＜0.05),與CN組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TMP+AG組外周血淋巴細(xì)胞與IR組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.Western Blot結(jié)果:
　　 (1)腎組織RAGE蛋白表達(dá):IR組顯著高于CN組(P＜0.05)。TMP+AG組明顯低于IR組(P＜0.05),與CN組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　 (2)IGF

9、-1R蛋白表達(dá):IR組腦、肝、腎較CN組明顯降低(P＜0.05)。TMP+AG組腦、肝、腎組織較IR組明顯升高(P＜0.05)。
　　 (3)Klotho蛋白表達(dá):IR組腎組織表達(dá)較CN組明顯降低(P＜0.05);TMP+AG組較IR組明顯升高(P＜0.05),與CN組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腦組織未檢測(cè)到該蛋白表達(dá)。
　　 6.免疫組化結(jié)果:
　　 (1)Klotho蛋白表達(dá):IR組腎組織Klotho蛋白表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)

10、胞胞漿被染成棕黃色,見圖3)較CN組明顯降低(P＜0.05),TMP+AG組較IR組表達(dá)明顯增加(P＜0.05),和CN組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),
　　 (2)IGF-1R蛋白表達(dá):IR組腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合小管IGF-1R蛋白表達(dá)較CN組減少(P＜0.05);TMP+AG組較IR組增加,與cN組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.STZ可以誘導(dǎo)出生當(dāng)日Wistar大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。該胰島

11、素抵抗大鼠FPG、FINS、IRI和GSP隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高,其存活時(shí)間明顯縮短。
　　 2.該IR大鼠腎組織Klotho mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),RAGE mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);應(yīng)用TMP+AG治療可使大鼠腎組織KlothomRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),RAGE mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),并使大鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
　　 3.TMP+AG延長(zhǎng)IR大鼠存活時(shí)間作用與調(diào)控IR大鼠多器官組織的Ins/IGF-1信號(hào)系統(tǒng)功能的平衡有關(guān)