中藥對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的抑制作用.pdf

1、中藥藥動(dòng)學(xué)研究是中藥走向現(xiàn)代化之路的重要途徑,但這一直是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一,大多數(shù)中藥在體內(nèi)的代謝尚不清楚,致使其臨床應(yīng)用缺乏科學(xué)依據(jù),從而影響療效或引起不良反應(yīng)。藥物不良反應(yīng)多由藥物相互作用引起,而代謝性相互作用的發(fā)生率最高。藥物代謝主要依賴于肝臟中的細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶系(cytochromeP450,CYP450)。CYP介導(dǎo)的藥物相互作用主要為酶誘導(dǎo)和酶抑制,酶抑制是引起藥物相互作用的重要原因。近年來(lái),有關(guān)中藥引起的

2、藥物相互作用逐漸受到重視。臨床上中藥的主要應(yīng)用形式是復(fù)方制劑。當(dāng)多種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí),就很容易出現(xiàn)不良反應(yīng)。由于中藥組成的復(fù)雜性,由中藥引起的相互作用機(jī)制尚不清楚。因此,研究中藥對(duì)CYP450的影響就顯得非常具有實(shí)際意義。
　　目的：本論文擬采用體外實(shí)驗(yàn),研究燈盞細(xì)辛注射液等37種中藥及其主要有效成分對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的影響,初步篩選出對(duì)這三種酶有抑制作用的中藥;采用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證香丹注射液、血

3、塞通注射液和銀黃口服液對(duì)大鼠CYP2C19的抑制作用,從而為確定細(xì)胞色素P450酶(CYP450)在中藥代謝中的作用,闡明中藥對(duì)大鼠CYP450的作用,豐富中醫(yī)基礎(chǔ)理論、預(yù)測(cè)藥物相互作用和中藥的安全性評(píng)價(jià)以及指導(dǎo)臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　方法：1.體外篩選對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥1.1大鼠肝微粒體制備取肝臟采用鈣沉淀法制備肝微粒體。1.2肝微粒體蛋白含量測(cè)定Bradford法測(cè)定肝微粒體蛋

4、白含量。1.3孵育反應(yīng)實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組中加入中藥,對(duì)照組加入等體積的磷酸鹽緩沖液。孵育體系總體積CYP2D6為500μl,CYP1A2和CYP2C19為200μl。反應(yīng)體系中包含NADPH,磷酸鹽緩沖液,EDTA,MgCl2,微粒體蛋白和相應(yīng)的探針?biāo)幬?分別是氫溴酸右美沙芬,非那西丁,奧美拉唑)。1.4酶活性測(cè)定以探針?biāo)幬锏霓D(zhuǎn)化程度作為酶活性的指標(biāo)。1.5探針?biāo)幬锓椒▽W(xué)考察建立測(cè)定大鼠肝微粒體中氫溴酸右美沙芬、非那西丁和奧美

5、拉唑的HPLC法,并按生物樣品的測(cè)定要求,對(duì)方法的專屬性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性、回收率和線性范圍等進(jìn)行考察。1.6肝微粒體蛋白濃度和孵育時(shí)間對(duì)探針?biāo)幬锎x的影響分別設(shè)定不同的肝微粒體蛋白濃度和孵育時(shí)間,考察與探針?biāo)幬锎x的關(guān)系,確定最佳蛋白濃度和孵育時(shí)間。分別確定0.75mg·ml-1、0.75mg·ml-1、0.20mg·ml-1和40min、30min、20min作為CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19孵育體系的肝微粒體蛋白

6、濃度和孵育時(shí)間。2.血塞通注射液、香丹注射液和銀黃口服液對(duì)大鼠CYP2C19的抑制作用2.1給藥方案按照隨機(jī)對(duì)照原則,血塞通注射液、香丹注射液、銀黃口服液分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只雄性SD大鼠,實(shí)驗(yàn)組分別給予血塞通注射液(4.17ml·kg-1)、香丹注射液(10.42ml·kg-1)、銀黃口服液(31.25ml·kg-1),對(duì)照組分別給予相應(yīng)等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥7天。2.2肝微粒體制備及蛋白含量測(cè)定末次給藥后24小時(shí)斷頭

7、處死大鼠,取肝臟采用鈣沉淀法制備肝微粒體,Bradford法測(cè)定肝微粒體蛋白含量。2.3孵育反應(yīng)孵育體系包含NADPH,磷酸鹽緩沖液,EDTA,MgCl2,微粒體蛋白和奧美拉唑。2.4色譜條件色譜柱5μm DiamonsiL C18柱(4.6mm×200mm),流動(dòng)相為甲醇:乙腈:0.1mol·L-1乙酸銨溶液=10:35:55,流速1.0ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)302nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量30μl。2.5酶活性測(cè)定采用高效液相色譜

8、法(HPLC)測(cè)定奧美拉唑的濃度,以?shī)W美拉唑的轉(zhuǎn)化程度(TR)作為酶活性的指標(biāo)。3.統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差((A)±S)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間酶的活性差異。a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.體外篩選對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥1.1探針?biāo)幬锓椒▽W(xué)考察肝微粒體樣品中雜質(zhì)不干擾氫溴酸右美沙芬、非那西丁、奧美拉唑的測(cè)定,日內(nèi)和日

9、間變異系數(shù)均小于15％,肝微粒體中探針?biāo)幬锏木€性范圍分別為5.0~160.0μmol·L-1、6.25~200.0μmol·L-1、1.0~32.0μmol·L-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.9994、0.9996、0.9998;樣品處理簡(jiǎn)單快速,方法的靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度均達(dá)到生物樣品的分析要求。1.2對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中藥通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),從37種中藥中篩選出血塞通注射液、清開(kāi)靈注射

10、液、銀黃口服液、藍(lán)芩口服液4種中藥對(duì)CYP2D6酶的活性有顯著抑制作用(P<0.05);清開(kāi)靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液3種中藥對(duì)CYP1A2酶的活性有顯著抑制作用(P<0.05);茵梔黃注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、穿心蓮注射液、血塞通注射液、銀黃口服液6種中藥對(duì)CYP2C19酶的活性有顯著抑制作用(P<0.05)。1.3中藥對(duì)大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的IC50血塞通注射液、清開(kāi)靈注射液、銀黃口服液、

11、藍(lán)芩口服液對(duì)CYP2D6酶的IC50分別為0.99ml·100ml-1、0.65ml·100ml-1、0.15ml·100ml-1、0.14ml·100ml-1;清開(kāi)靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液對(duì)CYP1A2酶的IC50分別為3.55ml·100ml-1、2.43ml·100ml-1、2.49ml·100ml-1;茵梔黃注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、穿心蓮注射液、血塞通注射液、銀黃口服液對(duì)CYP2C19酶的IC50分別為0.

12、67ml·100ml-1、0.64ml·100ml-1、0.90ml·100ml-1、0.81ml·100ml-1、0.75ml·100ml-1、0.056ml·100ml-1。上述中藥對(duì)CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19酶的抑制作用呈濃度依賴性。1.4中藥與其有效成分的比較清開(kāi)靈注射液與其主要有效成分(黃芩苷+梔子苷)對(duì)CYP2D6的抑制作用無(wú)顯著差別(P>0.05)。銀黃口服液和藍(lán)芩口服液對(duì)大鼠CYP2D6的抑制作用顯著強(qiáng)于

13、其相應(yīng)主要有效成分(分別為黃芩苷和梔子苷)(P<0.05);茵梔黃注射液、清開(kāi)靈注射液、穿心蓮注射液與其相應(yīng)有效成分(分別為黃芩苷+梔子苷、黃芩苷+梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯)對(duì)大鼠CYP1A2的抑制作用和茵梔黃注射液、雙黃連注射液、銀黃口服液、血塞通注射液與其相應(yīng)有效成分(分別為黃芩苷+梔子苷、黃芩苷、黃芩苷、三七總皂苷)對(duì)大鼠CYP2C19的抑制作用均無(wú)顯著差別(P>0.05)。2.血塞通注射液、香丹注射液和銀黃口服液對(duì)大鼠CYP2C19的

14、抑制作用靜脈注射血塞通注射液對(duì)大鼠CYP2C19有顯著抑制作用(P<0.01),靜脈注射香丹注射液和灌胃給予銀黃口服液對(duì)大鼠CYP2C19均無(wú)顯著抑制作用(P>0.05)。
　　結(jié)論:1.血塞通注射液、清開(kāi)靈注射液、銀黃口服液、藍(lán)芩口服液體外對(duì)大鼠CYP2D6酶活性有顯著抑制作用;清開(kāi)靈注射液、茵梔黃注射液、穿心蓮注射液體外對(duì)大鼠CYP1A2酶活性有顯著抑制作用;茵梔黃注射液、血塞通注射液、香丹注射液、雙黃連注射液、銀黃口服液、穿