H1N2、H3N2及H5N1亞型豬流感病毒進(jìn)化及致病性研究.pdf

1、豬流感是引起豬的高度接觸性病毒病，對(duì)感染畜群造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并具有重要的公共衛(wèi)生意義。豬流感病原主要包括H1N1，H1N2，H3N2等亞型A型流感病毒。豬作為流感病毒的中間宿主，具有混合器作用，人、禽流感病毒可以在其體內(nèi)重組產(chǎn)生新病毒。開(kāi)展豬流感流行病學(xué)檢測(cè)及致病分離株的演化規(guī)律具有重要意義。 本研究先后在上海、河南、山爾、湖北、江蘇、廣東等省市采集豬鼻拭子5886份和血清5788份。血清樣品檢測(cè)結(jié)果如下：H1陽(yáng)性率40％(

2、2323份)，H3陽(yáng)性率90％(5240份)，H5陽(yáng)性率0.086％(5份)，H9陽(yáng)性率0.138％(8份)。豬鼻拭子樣品同時(shí)接種MDCK和SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，共分離到4株H1N2，6株H3N2和1株H5N1流感病毒。結(jié)果表明當(dāng)前我國(guó)不同地區(qū)豬群中普遍存在H1和H3亞型豬流感流行。 為了解我國(guó)豬流感病毒分子進(jìn)化變異情況，本研究挑選H1N2代表毒株Swine/Guangdong/1/2006(SwGD1/06)和H3N2代表毒

3、株Swine/Guangdong/1/2006(SwGD1/05)進(jìn)行基因組測(cè)定分析。結(jié)果表明SwGD1/06(H1N2)可能來(lái)源于北美豬群中流行的H1N2亞型豬流感病毒；而SwGD1/05(H3N2)可能能來(lái)源于在北美人群中流行的H3N2亞型流感病毒。分別用106EID50劑量H1N2和H3N2分離病毒對(duì)H1、H3、H5、H9抗體皆為陰性的35日齡仔豬進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是感染后第1、3、5、7d能從豬鼻拭子中重新分離到H1N2和H3N

4、2病毒，其中第3d病毒含量最高；其它臟器沒(méi)有分離到病毒。臨床癥狀輕微，沒(méi)有豬只死亡。結(jié)果表明單純H1N2或H3N2流感病毒能在不引起臨床癥狀的情況下感染易感豬只，這說(shuō)明我國(guó)流行的H1和H3流感病毒對(duì)豬致病性不強(qiáng)。 為闡明H5N1亞型豬流感病毒跨種傳播遺傳基礎(chǔ)，本研究篩選遺傳關(guān)系相近(整個(gè)基因組只有23個(gè)氨基酸差異)，對(duì)小鼠感染能力完全不同的的兩株H5N1亞型流感病毒為模型病毒：DK/ZJ/52/00(DK52)，對(duì)小鼠完全不感染

5、；Swine/Fujian/1/04(FJ1)，對(duì)小鼠有致病性且引起小鼠死亡。建立了FJ1和DK52的反向遺傳操作系統(tǒng)，分別以FJ1和DK52為背景，利用反向遺傳技術(shù)在293T細(xì)胞上救獲單基因替換重組的16個(gè)病毒。這些病毒分別以106EID50劑量鼻腔感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DK52的PA和M基因分別替換FJ1相應(yīng)基因，使RFJ1在小鼠肺臟感染能力降低103.21倍(病毒滴度(LgEID50)由原來(lái)的4.71變?yōu)?.5)；反之FJ1的PA和

6、M基因分別替換DK52的相應(yīng)基因，使RDK52的致病性由不感染變?yōu)楦腥?肺臟病毒滴定結(jié)果為L(zhǎng)gEID50，1.5)。其它單基因替換重組病毒沒(méi)有改變這兩株病毒對(duì)小鼠感染能力。結(jié)果表明M和PA基因影響FJ1和DK52在小鼠肺臟中的復(fù)制能力。 為進(jìn)一步確定PA和M基因如何影響對(duì)FJ1利DK52對(duì)小鼠感染能力，我們把M和PA兩個(gè)基因同時(shí)替換，發(fā)現(xiàn)以DK52的PA和M替換FJ1的PA和M基因后，使RFJ1/DK52PA+M不能在小鼠肺臟中

7、復(fù)制；反之，以FJ1的PA和M替換DK52的PA和M基因后，導(dǎo)致RDK52/FJ1PA+M能感染小鼠并在肺臟中復(fù)制，病毒滴度達(dá)到2.5LgEID50。結(jié)果表明M和PA基因協(xié)同作用影響FJ1和DK52對(duì)小鼠感染能力。 在此基礎(chǔ)上，我們分析FJ1和DK52兩株病毒的PA和M基因氨基酸，發(fā)現(xiàn)PA(54、330,384,459)和M2(26)基因分別有4個(gè)和1個(gè)位點(diǎn)氨基酸不同。為進(jìn)一步確定PA和M2的哪一個(gè)位點(diǎn)氨基酸對(duì)小鼠感染能力起作用

8、，分別對(duì)PA和M2的兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，利用反向遺傳操作系統(tǒng)救獲4個(gè)點(diǎn)突變病毒。突變病毒對(duì)小鼠感染結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PAI54V(54位由I變?yōu)閂)可使RFJ1在小鼠肺臟中復(fù)制能力降低103.21倍(LgEID50由原來(lái)的4.71變?yōu)?.5)，反之，PAV54I(54位由V變?yōu)镮)可使RDK52對(duì)小鼠由不感染變?yōu)楦腥?肺臟病毒滴定結(jié)果為L(zhǎng)gElD50，1.5)；同樣，M2S26L(26位由S變?yōu)長(zhǎng))可以使FJ1感染小鼠能力降低1O3.21倍(L

9、gEID50由原來(lái)的4.71變?yōu)?.5)，反之M2L26S(26位由L變?yōu)镾)可以可使RDK52對(duì)小鼠由不感染變?yōu)楦腥?肺臟病毒滴定結(jié)果為L(zhǎng)gEID50，1.5)。但是PA的330，384，459位氨基酸的改變沒(méi)有影響病毒致病性。結(jié)果表明PA基因的54位和M2基因的26位氨基酸協(xié)同作用影響FJ1和DK52對(duì)小鼠感染能力。 本研究系統(tǒng)研究了中國(guó)部分地區(qū)豬流感病毒流行的亞型和生物學(xué)特性，結(jié)果表明：中國(guó)目前豬群中主要流行H1和H3亞型

10、流感毒株，而且H1和H3呈普遍感染狀態(tài)；H1N2和H3N2可能分別來(lái)源于北美H1N2亞型豬流感病毒和北美H3N2亞型人流感病毒；H1N2和H3N2流感病毒可以在不引起臨床癥狀情況下感染豬并且病毒能在上呼吸道中大量復(fù)制，這對(duì)闡明豬流感病毒感染致病機(jī)制具有一定的理論意義，同時(shí)對(duì)豬流感臨床診斷具有一定的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)作用。利用反向遺傳操作和定點(diǎn)突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)PA的54位和M2的26位氨基酸協(xié)同影響FJ1和DK52對(duì)小鼠感染能力，這為闡明H5N1亞型流