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文檔簡介
1、紫杉醇(Taxol)是從紫杉樹皮中分離提取到的天然抗腫瘤物質(zhì),是迄今為止最具抗癌活性的天然化合物之一,紫杉酚能夠抑制細(xì)胞在G2-M期增殖,阻斷有絲分裂,從而有效抑制癌細(xì)胞增生。然而紫杉醇在植物體內(nèi)含量相當(dāng)?shù)?,加之其生長緩慢,這對紫杉醇的進(jìn)一步開發(fā)利用造成了很大的困難。紫杉烷13α–羥基化酶(Taxane13α-hydroxylase)屬于依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶,為紫杉醇合成途徑的關(guān)鍵羥化酶,是紫杉醇及其半合成前體生物合成調(diào)控的十
2、分重要的靶標(biāo)。本研究克隆得到我國東北紅豆杉(Taxus cuspidata)紫杉烷13α-羥基化酶基因,構(gòu)建了其植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。在此基礎(chǔ)上克隆了幾個可能與紫杉烷13α-羥基化酶基因相作用的microRNA(miRNA)基因,構(gòu)建其植物表達(dá)載體并進(jìn)行了其中miRNA基因與紫杉烷13α-羥基化酶基因共轉(zhuǎn)化試驗。主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
(1)本研究克隆得到東北紅豆杉13OH的基因全長,將它與報道的13OH基因進(jìn)行同源性
3、比較后發(fā)現(xiàn)9個堿基有差異,同源性為99.38%。
?。?)根據(jù)不同的報告基因要求,成功構(gòu)建了13OH基因在 Pcambia1305.1和pcambia1304及pEGAD上的三種植物表達(dá)載體,分別含有GUS基因、GUS和mGFP5、EGFP作為報告基因。
(3)將構(gòu)建在Pcambia1305.1的13OH基因成功轉(zhuǎn)化到煙草中,獲得可在煙草中表達(dá)13α-羥基化酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
?。?)從水稻及擬南芥中克隆
4、出miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d小調(diào)節(jié)子前體,測序結(jié)果表明除164e有一個堿基差異166m有兩個堿基差異外,其余同源性為100%。
(5)分別構(gòu)建了miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d在Pcambia1305.1上和miR165a、miR169d在pEGAD上的七種植物表達(dá)載體,便于不同的篩選。
?。?)瞬時轉(zhuǎn)化GUS染色結(jié)果顯示
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