紅豆杉紫杉烷13α-,14β-羥基化酶基因調控及茉莉酸甲酯誘導下的蛋白表達.pdf

1、紫杉醇（taxol）是Wall等首次從短葉紅豆杉(TaxusBrevifolia)樹皮中分離得到的一種重要的次生代謝產物，是迄今為止最具抗癌活性的天然化合物之一。本論文圍繞紫杉醇的生物合成過程展開了以下研究：
　　 1、紫杉烷13α-，14β-羥基化酶基因調控研究
　　 紫杉醇生物合成全過程約20步酶促反應。其中，紫杉烷13α-羥基化酶(簡稱13OH)是紫杉醇生物合成途徑的關鍵羥化酶。而紫杉烷14β-羥基化酶(簡稱14O

2、H)存在于包括紫杉醇在內的各種C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途徑中。如果能夠抑制紫杉醇生物合成的分支途徑，則有可能提高該物質的生物合成產量。應用本試驗室構建好的紫杉烷13α-羥基化酶基因正向表達載體、14-β羥基化酶基因反義RNA表達載體、14-β羥基化酶基因RNAi表達載體和幾種可能對紫杉醇生物合成產生影響的miRNA表達載體，以曼地亞紅豆杉（Taxusxmedia）愈傷組織細胞為材料進行了轉化實驗，并運用southernblot

3、、RT-PCR、HPLC等技術進行了分析，結果如下：
　　 (1)建立了一套將轉基因方法應用于紅豆杉培養(yǎng)細胞的高效、完整的轉化體系，對紅豆杉愈傷組織細胞的轉化成功率達到了100％。并探討了幾種影響轉化效率的因素。
　　 (2)利用14-β羥基化酶基因RNAi表達載體(pZ14aRNAi、pZ14bRNAi)以及14-β羥基化酶基因反義RNA表達載體(pZ14c)進行了轉化紅豆杉細胞實驗。Southern檢測初步證實外源基

4、因已經整合到了植物基因組中；RT-PCR分析結果表明，內參基因β-actin在轉基因和非轉基因細胞中表達水平基本一致，而14OH基因在轉基因細胞系中的表達水平相對非轉基因細胞系顯著下降。HPLC結果分析顯示，轉基因的紅豆杉細胞與對照相比三種C-14氧取代紫杉烷(yunnanxane，sinenxanA，sinenxanC)的含量發(fā)生了較大的改變。其中主要的紫杉烷SinenxanA含量明顯下降，三種紫杉烷在轉基因紅豆杉細胞中的總含量呈顯著

5、下降趨勢。
　　 (3)利用pC13OH載體轉化紅豆杉細胞實驗。GUS檢測，熒光觀察及southernblot分析初步證明pC13OH載體（13α-羥基化酶基因正向表達載體）成功轉化紅豆杉細胞。RT-PCR結果表明，內參基因β-actin在轉基因和非轉基因細胞中表達水平一致，而13OH基因在轉基因細胞系中的表達水平顯著，卻在對照中未表達。HPLC檢測三種C-14氧取代紫杉烷類化合物的總量在轉基因細胞中均略微有所下降。
　　

6、 (4)其他轉化紅豆杉細胞的實驗。本研究還進行了pC13OH、pZ14a共轉化，pC13OH、pZ14b共轉化，pC130H、pZ14c共轉化，pC13OH、pCO169d共轉化，pC13OH、pE415共轉化紅豆杉細胞的實驗。另外，利用構建的幾種miRNA表達載體如169d、pROK2-JERFs也對曼地亞紅豆杉細胞進行了轉化。對轉化后的樣品進行分析顯示，共轉化試驗及幾種miRNA表達載體均未對紫杉醇生物合成途徑產生較大影響。

7、>　　 2、茉莉酸甲酯誘導下紅豆杉細胞中蛋白質的表達
　　 已有的研究表明采用茉莉酸甲酯(MJ)誘導可以有效的提高紫杉醇及紫杉烷類物質在紅豆杉細胞中的含量。研究該物質誘導的作用機制，可以更全面了解茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞基因表達的影響，找到可能與紫杉醇生物合成相關的重要基因或轉錄因子。本試驗利用茉莉酸甲酯誘導中國紅豆杉（Taxuschinensis）愈傷組織細胞，采用雙向電泳技術、質譜技術對茉莉酸甲酯誘導15天后細胞中的蛋白質變

8、化進行了分析，找到22個差異表達的蛋白。經過肽質量指紋分析、數據庫查詢，初步斷定CK(對照組)中的219號、231號、156號、127號蛋白分別與actin2（一種細胞骨架蛋白）、enolase（烯醇酶，一種參與糖酵解系統(tǒng)的酶，催化2-磷酸甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反應的酶）、F1-ATP酶α亞單位、maturaseK（一種成熟酶）具有同源性。經過茉莉酸甲酯誘導后，該四種蛋白的表達量均有不同程度的降低。這可能與茉莉酸甲酯誘導引起紅豆

9、杉細胞的凋亡有關。另外，有10個蛋白與數據庫中所有蛋白的同源性都很低，可能代表了中國紅豆杉中與茉莉酸甲酯誘導相關的未知蛋白。
　　 3、抗凋亡抑制劑DEVD-CapaseⅢ對紫杉醇生物合成的影響
　　 DEVD-CapaseⅢ是一種抗細胞凋亡抑制劑，在紅豆杉細胞培養(yǎng)基加入該物質則有可能抑制細胞的凋亡從而達到提高紫杉醇生物合成產量的目的。以曼地亞紅豆杉愈傷組織作為實驗材料，采用添加200μMMj（茉莉酸甲酯）的6，7-V作

10、為培養(yǎng)基，試驗組加入50μM的Ac-DEVD-CMK，分別在繼代9天和21天后取樣，觀察細胞的顏色、生長情況等，并運用HPLC方法對細胞中的紫杉烷成分的種類及含量進行分析。結果發(fā)現(xiàn)：MJ誘導后并未在曼地亞紅豆杉細胞中檢測到紫杉醇的變化，說明本試驗中細胞的凋亡并不是主要由于紫杉醇的積累而是由于MJ引發(fā)的反應；在細胞生長周期的早期階段加入Ac-DEVD-CMK，不能阻止Caspase的活性，未能抑制愈傷組織細胞的凋亡。
　　 4、未

11、知化合物的鑒定
　　 無論是在轉基因還是MJ誘導試驗過程中，我們均檢測到了一種未知化合物，并對該化合物進行了純化試驗。該物質在HPLC色譜圖上的保留時間比紫杉醇的保留時間延遲了大約0.4min。將該物質的二級質譜圖與分子量類似的已知化合物的譜圖進行比對，沒有發(fā)現(xiàn)完全吻合的質譜特征。經過HPLC-HRMS分析得到該未知化合物分子量為851.39747，在Xcaliburversion2.2軟件中計算得到最可能是C46H55O10N

12、6等化合物中的一種。
　　 結論：(1)本實驗建立了一套高效轉基因體系，并應用轉基因技術成功地抑制了曼地亞紅豆杉細胞系中14OH基因的表達，C-14位氧化紫杉烷類含量在轉基因細胞系中均有所下降；(2)在采用茉莉酸甲酯(MJ)誘導中國紅豆杉愈傷組織細胞的試驗中，鑒定了四種并發(fā)現(xiàn)了10個可能與茉莉酸甲酯誘導有關的蛋白；(3)抗凋亡抑制劑DEVD-CapaseⅢ未對紫杉醇生物合成產生較大的影響；(4)在實驗過程中檢測到了一種有可能縣未