XAGE-1b基因與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性及在部分頭頸惡性腫瘤中表達的研究.pdf

1、本文首先應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractivehybridization，SSH)篩選ACC肺高、低轉(zhuǎn)移細胞ACC-M和ACC-2中差異表達基因，分析肺高轉(zhuǎn)移細胞ACC-M中的高表達轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對其中的一個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因XAGE-1b進行基因功能方面的初步研究，探討XAGE-1b基因在涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性；此外，還應(yīng)用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent

2、 quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測部分頭頸惡性腫瘤患者瘤組織標本中XAGE-1b mRNA的表達水平，以進一步探討該基因在頭頸腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。 實驗方法： 1．細胞： 人涎腺ACC高轉(zhuǎn)移細胞株ACC-M和低轉(zhuǎn)移細胞系A(chǔ)CC-2(上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口外腫瘤實驗室提供)。 2.mRNA分離純化和抑制性消減雜交： 取RPMI 1640及5％CO<,2>和雙抗條件下培養(yǎng)3天

3、的ACC-2和ACC-M細胞，0.125％胰酶消化。按Trizol試劑說明書抽提總RNA，按Oligotex<'TM>說明書分離mRNA。抑制性消減雜交全部操作按照CLONTECH公司操作手冊PT-1117進行。 3.差異顯示片段的克隆及同源性比較： 將差異顯示獲得的DNA片段純化，參照pGEM-T Vectot Kit操作手冊建議的方案設(shè)計連接體系?？寺∮趐GEM-T載體。挑選陽性克隆測序，獲得的序列在NCBI的Bla

4、stN中進行同源性分析。 4.RNA斑點雜交及RT-PCR分析： 對抑制性消減雜交中獲得的基因序列進一步利用RNA斑點雜交及RT-PCR進行驗證是否存在差異表達。 5．XAGE-1b基因siRNA表達載體的構(gòu)建： 帶有U6啟動子的pcDNA3.1siRNA表達載體(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒及分子免疫實驗室構(gòu)建)，U6啟動子序列按照GenBank序列(ACCess ionnumber X06980)化學(xué)合成

5、并克隆到pcDNA3．1B(-)載體上，替代原有的CMV啟動子，獲得所需的siRNA表達載體pcDNA3．1-U6。 6．轉(zhuǎn)染： 按照Invitrogen的產(chǎn)品說明，用脂質(zhì)體lipofectamine 2000將XAGE-1b基因干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染ACC-2和ACC-M細胞，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細胞稱為ACC2-X，ACCM-X，24-48h后收集細胞，pEGFP質(zhì)粒作為各組轉(zhuǎn)染效率對照。 7.RT-PCR檢測

6、XAGE-1b基因干擾效率： 抽提轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞RNA，取0.6μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板檢測XAGE-1b基因表達量的改變，G3PDH基因作為對照。 8.Boyden小室檢測腫瘤細胞體外遷移能力： 9.裸鼠體內(nèi)檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的改變： 8w齡雌性BALB/C nu/nu裸小鼠38只，分組，在距尾尖2～3cm處尾靜脈注入各組腫瘤細胞懸液0.1ml/只。1w后重復(fù)注射1次。8w后處死的

7、裸鼠，無菌條件下解剖取出肺臟。凡肉眼可見轉(zhuǎn)移灶者，顯微鏡下手術(shù)剪剝離，余下肺組織和分離的轉(zhuǎn)移灶用Satorium電子天平分別稱重記錄，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)處理。 10.頭頸惡性腫瘤患者標本收集后模板RNA提?。?臨床收集到的頭頸惡性腫瘤患者標本組織總RNA提取按說明書(Invitrogen公司)操作，通過1％甲醛瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析RNA質(zhì)量和濃度。

8、 11.實時熒光定量PCR檢測標本中XAGE-1b mRNA的表達： 每個樣本重復(fù)2次。計算機自動獲取標本中XAGE-1b和GAPDH的Ct值，對照標準曲線計算每個樣本XAGE-1b和GAPDH基因的拷貝數(shù)。結(jié)果以XAGE-1b和GAPDH基因拷貝數(shù)的比值表示相對表達量。 實驗結(jié)果： 1.差異表達基因克隆及同源性比較： 本實驗以ACC-M為測試子，ACC-2為驅(qū)動子進行抑制性消減雜交，在ACC-M中獲得

9、了6個相對于ACC-2高表達的差異基因，均為已知基因片段。 2.RNA斑點雜交和RT-PCR分析結(jié)果： 2.1 RNA斑點雜交驗證： 對獲得的差異表達序列以G3PDH為對照用RNA斑點雜交進行半定量驗證。結(jié)果與SSH結(jié)果基本一致。在呈差異表達的基因中，有6個基因在ACC-M 細胞中高表達，其表達量是．ACC-2的2倍以上。 2.2 RT-PCR驗證： 對肺高轉(zhuǎn)移細胞ACC-M中的編號m-12基因(

10、XAGE-1b gene forcancer-associated protein)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR分析，結(jié)果均可見有明顯擴增條帶，同時以G3PDH作內(nèi)參對照，顯示m-12基因在ACC-M細胞中相比于ACC-2 細胞呈高表達，根據(jù)圖象掃描定量分析，在ACC-M 和ACC-2 細胞中該基因表達量相差達3倍以上。 3.干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后RT-PCR 驗證XAGE-1b基因表達量的改變： 以G3PDH為對照檢測ACC-M和ACC-2

11、細胞中XAGE-1b基因表達量的改變，同時以空質(zhì)粒和帶有陰性干擾片斷的質(zhì)粒作為對照，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細胞中XAGE-1b表達量相比對照質(zhì)粒中XAGE-1b表達量顯著下降。 4.Boyden小室檢測腫瘤細胞體外遷移能力： XAGE-1b基因干擾后，利用Boyden小室和Matrigel模擬胞外基質(zhì)檢測細胞遷移粘附能力，同時以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒的細胞作為對照，結(jié)果ACC-2、ACC-M與其它對照組比較有顯著性差異(p<0.0

12、1)。 5.裸鼠體內(nèi)腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移能力的改變： 注射細胞后每隔1～2d觀察小鼠狀態(tài)，至第8w末處死小鼠，解剖取肺臟，顯微鏡下分離轉(zhuǎn)移灶。3組裸鼠除肺以外其他部位均未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)腫大。XAGE-1b基因干擾后的細胞株在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶肉眼下不可見或數(shù)量少而小，肺部轉(zhuǎn)移灶重量均值與對照組比較有顯著性差異(p<0.01)。 6.部分頭頸惡性腫瘤患者標本擴增產(chǎn)物鑒定及測序結(jié)果： XAGE-1b和GAPDH擴增片

13、段經(jīng)2％瓊脂糖電泳，XAGE-1b和GAPDH擴增片段分別為345 bp和500 bp，與理論大小一致。測序結(jié)果與GenBank上比對，序列完全一致。 7.XAGE-1b在正常組織和頭頸惡性腫瘤組織中的表達： ACC、舌癌未轉(zhuǎn)移、舌癌轉(zhuǎn)移、口底癌和喉癌的相對表達量依次為0.0056±0.0070，0.00034±0.00046，0.018±0.021，0.0010±0.0010，0.00051±0.00091，差異有顯著

14、性(P<0.001)，由高到低排序為舌癌轉(zhuǎn)移>ACC>口底癌>喉癌>舌癌未轉(zhuǎn)移，提示XAGE-1b基因表達和轉(zhuǎn)移相關(guān)。6份癌旁正常組織和26份頭頸惡性腫瘤組織中XAGE-1b對GAPDH的相對表達量均值分別為0.00272±0.005和0.00478±0.011，2組差異有顯著性(P<0.001)，用REST軟件分析結(jié)果，提示頭頸惡性腫瘤組織中XAGE-1b表達水平上調(diào)。 研究結(jié)論： 1.應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)篩選到AC

15、C-M中相對于ACC-2的6個差異表達基因，這些基因在ACC-M中的高表達可能是涎腺腺樣囊性癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因。 2.RNA干擾作用抑制了XAGE-1b基因在ACC-M中的表達，在體外實驗和體內(nèi)檢測中明顯降低了ACC-M細胞遷移黏附以及肺轉(zhuǎn)移能力，初步證實了XAGE-1b基因在涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。 3．XAGE-1b基因在部分頭頸惡性腫瘤組織中表達高于癌旁正常組織。其表達量與頭頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。提