人涎腺腺樣囊性癌中RUNX3的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及與腫瘤臨床病理因素和預(yù)后之間的相關(guān)性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)： 第一章：5-氮唑-2'—脫氧胞苷(5-Aza—dc)對(duì)ACC-2、ACC-3和ACC—M細(xì)胞株RUNX3表達(dá)的影響 腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinoma，ACC)是涎腺中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占所有涎腺上皮性腫瘤的10％，其臨床特點(diǎn)是生長(zhǎng)緩慢，但侵襲性較強(qiáng)，易侵犯神經(jīng)及血管，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)40％。然而目前對(duì)該腫瘤的高侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍缺乏了解。人類(lèi)Runt相關(guān)

2、轉(zhuǎn)錄因子-3(humanrunt—relatedtranscriptionfactor-3，RUNX3)是在胃癌中新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，由該基因甲基化引起的表達(dá)減少或缺失與胃癌的高侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而在一些腫瘤細(xì)胞株中這種甲基化狀態(tài)可以被DNA甲基化的逆轉(zhuǎn)錄酶5-氮唑-2’—脫氧胞苷(5-Aza—dc)在體外環(huán)境中逆轉(zhuǎn)?；赗UNX3基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，因而對(duì)RUNX3基因及蛋自在涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況作一探討。

3、 實(shí)驗(yàn)一分別用RT—PCR、免疫熒光化學(xué)和Westernblot檢測(cè)ACC-2、ACC-3和ACC—M細(xì)胞在5-Aza—dc處理前后的RUNX3的表達(dá) 無(wú)菌條件下取腺樣囊性癌ACC-2和ACC-3細(xì)胞株以及肺高轉(zhuǎn)移性腺樣囊性癌ACC—M細(xì)胞株，將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞活力，傳代培養(yǎng)后加入300nmol/L5-Aza—dc共培養(yǎng)72hrs后，分別提取總RNA

4、和蛋白質(zhì)，檢測(cè)RUNX3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。Westernblot結(jié)果用Image—ProPlus軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算RUNX3蛋白產(chǎn)物的相對(duì)量。 第二章：涎腺腺樣囊性癌中RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的關(guān)鍵位點(diǎn)和演進(jìn)規(guī)律 一些研究表明，RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化是該基因表達(dá)沉默的主要方式之一。前一章結(jié)果表明腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2、ACC-3和ACC—M細(xì)胞株

5、在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza—dc共培養(yǎng)后RUNX3表達(dá)有所增加，提示在該腫瘤中RUNX3基因存在甲基化。RUNX3基因作為一個(gè)新的抑癌基因，在多種惡性腫瘤中由于啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致表達(dá)抑制甚至缺失。但腺樣囊性癌中RUNX3基因沉默的機(jī)制目前尚未闡明。因此在本章中對(duì)人涎腺腺樣囊性癌及相應(yīng)的正常涎腺組織標(biāo)本中RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島多位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與RUNX3基因甲基化和臨床病理指標(biāo)之間的相互關(guān)系作一比較分析，對(duì)腺樣囊性癌中R

6、UNX3基因甲基化的關(guān)鍵位點(diǎn)和演進(jìn)規(guī)律作初步探討，以更好地了解其分子機(jī)制。 試驗(yàn)二以定量甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測(cè)41例涎腺腺樣囊性癌及其相應(yīng)的正常涎腺組織中RUNX3基因的甲基化狀態(tài)以及RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島第1-10位點(diǎn)中各位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，用LogisticANOVA模型分析烈RUNX3基因及各位點(diǎn)甲基化在涎腺腺樣囊性癌中發(fā)生的危險(xiǎn)度，并比較RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化與腺樣囊性癌臨床病理因素之間的相關(guān)性。同

7、時(shí)用Westernblot法檢測(cè)19例經(jīng)過(guò)qMSP檢測(cè)的腺樣囊性癌及其匹配的正常涎腺組織中RUNX3蛋白的表達(dá)，以分析RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)蛋白表達(dá)的影響。 第三章：RUNX3在涎腺腺樣囊性癌和正常涎腺中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性 涎腺腺樣囊性癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后較差。目前的一些研究認(rèn)為外科切緣陽(yáng)性、臨床分期、病理類(lèi)型、神經(jīng)侵犯等是腺樣囊性癌患者的一個(gè)預(yù)后因素。同時(shí)，在分子水平一些研究者認(rèn)為一些增殖或凋亡相關(guān)基因與腺樣

8、囊性癌患者的預(yù)后相關(guān)。RUNX3作為在胃癌中新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其表達(dá)的沉默與胃癌的發(fā)生和發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著高度的相關(guān)性，而且也影響著胃癌的治療效果和預(yù)后，因此檢測(cè)惡性腫瘤中RUNX3的表達(dá)可能提供一個(gè)比較好的預(yù)后指標(biāo)。由于腺樣囊性癌患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差的一個(gè)主要因素，雖然在涎腺腺樣囊性癌中沒(méi)有關(guān)于RUNX3表達(dá)的報(bào)道，基于RUNX3與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，探討RUNX3在ACC中的表達(dá)對(duì)判斷該腫瘤的發(fā)生進(jìn)展和預(yù)后都將有一個(gè)

9、參考作用。 試驗(yàn)三分別用熒光定量qRT—PCR、Westernblot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)RUNX3在正常涎腺和腺樣囊性癌中的表達(dá) 從液氮中取出9例正常涎腺(包括3例腮腺、2例舌下腺及2例頜下腺)和7例腺樣囊性癌組織，分別以熒光定量RT—PCR和Westernblot，檢測(cè)RUNX3mRNA和蛋白的表達(dá)情況。qRT—PCR結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定RUNX3mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot結(jié)果用Image—ProPl

10、us軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算RUNX3蛋白產(chǎn)物的相對(duì)量。同時(shí)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)73例石蠟包埋的腺樣囊性癌組織中RUNX3蛋白在腫瘤細(xì)胞中的定位表達(dá)情況。 試驗(yàn)四分析RUNX3表達(dá)與腺樣囊性癌臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性 以Image—ProPlus圖像分析軟件檢測(cè)RUNX3蛋白在73例腺樣囊性癌中的表達(dá)水平，并以Tertile法將其分為高表達(dá)組(≥14.91％)、中表達(dá)組(6.94％-1

11、4.91％)和低表達(dá)組(≤6.94％)，并分析RUNX3的表達(dá)水平與73例腺樣囊性癌的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。同時(shí)以Cox回歸模型評(píng)價(jià)各臨床病理指標(biāo)與預(yù)后的相關(guān)性，以Kaplan—Meier生存曲線(xiàn)檢測(cè)RUNX3表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響，從而評(píng)估RUNX3在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)對(duì)評(píng)價(jià)患者的預(yù)后的臨床價(jià)值． 結(jié)論： 1．RUNX3在腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2和ACC-3中存在表達(dá)，而在肺高轉(zhuǎn)移腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC—M中則

12、無(wú)表達(dá)。經(jīng)過(guò)300nmol/L的5─Aza—dc處理72小時(shí)后能提高RUNX3在這些細(xì)胞株中的表達(dá)。 2．人涎腺腺樣囊性癌中RUNX3基因甲基化的概率顯著高于正常涎腺組織，提示RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化是人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生的一個(gè)重要因素。 3．RUNX3基因CpG島的甲基化的規(guī)律是從5’區(qū)向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)方向演進(jìn)，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的甲基化程度最低，提示該位點(diǎn)為RUNX3基因甲基化的關(guān)鍵位點(diǎn)。 4．RUNX3基因C