人涎腺腺樣囊性癌中RUNX3的表達、甲基化狀態(tài)及與腫瘤臨床病理因素和預后之間的相關性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一章：5-氮唑-2'—脫氧胞苷(5-Aza—dc)對ACC-2、ACC-3和ACC—M細胞株RUNX3表達的影響 腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinoma，ACC)是涎腺中最為常見的惡性腫瘤之一，約占所有涎腺上皮性腫瘤的10％，其臨床特點是生長緩慢，但侵襲性較強，易侵犯神經(jīng)及血管，遠處轉移率高達40％。然而目前對該腫瘤的高侵襲性和遠處轉移的具體機制仍缺乏了解。人類Runt相關

2、轉錄因子-3(humanrunt—relatedtranscriptionfactor-3，RUNX3)是在胃癌中新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，由該基因甲基化引起的表達減少或缺失與胃癌的高侵襲性和遠處轉移密切相關，而在一些腫瘤細胞株中這種甲基化狀態(tài)可以被DNA甲基化的逆轉錄酶5-氮唑-2’—脫氧胞苷(5-Aza—dc)在體外環(huán)境中逆轉?；赗UNX3基因與腫瘤轉移的相關性，因而對RUNX3基因及蛋自在涎腺腺樣囊性癌細胞株中的表達情況作一探討。

3、 實驗一分別用RT—PCR、免疫熒光化學和Westernblot檢測ACC-2、ACC-3和ACC—M細胞在5-Aza—dc處理前后的RUNX3的表達 無菌條件下取腺樣囊性癌ACC-2和ACC-3細胞株以及肺高轉移性腺樣囊性癌ACC—M細胞株，將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。倒置相差顯微鏡下觀察細胞活力，傳代培養(yǎng)后加入300nmol/L5-Aza—dc共培養(yǎng)72hrs后，分別提取總RNA

4、和蛋白質，檢測RUNX3mRNA和蛋白質的表達。Westernblot結果用Image—ProPlus軟件進行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值進行標準校正，計算RUNX3蛋白產(chǎn)物的相對量。 第二章：涎腺腺樣囊性癌中RUNX3基因啟動子CpG島甲基化的關鍵位點和演進規(guī)律 一些研究表明，RUNX3基因啟動子CpG島高甲基化是該基因表達沉默的主要方式之一。前一章結果表明腺樣囊性癌細胞株ACC-2、ACC-3和ACC—M細胞株

5、在DNA甲基化轉移酶抑制劑5-Aza—dc共培養(yǎng)后RUNX3表達有所增加，提示在該腫瘤中RUNX3基因存在甲基化。RUNX3基因作為一個新的抑癌基因，在多種惡性腫瘤中由于啟動子甲基化而導致表達抑制甚至缺失。但腺樣囊性癌中RUNX3基因沉默的機制目前尚未闡明。因此在本章中對人涎腺腺樣囊性癌及相應的正常涎腺組織標本中RUNX3基因啟動子CpG島多位點的甲基化狀態(tài)與RUNX3基因甲基化和臨床病理指標之間的相互關系作一比較分析，對腺樣囊性癌中R

6、UNX3基因甲基化的關鍵位點和演進規(guī)律作初步探討，以更好地了解其分子機制。 試驗二以定量甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測41例涎腺腺樣囊性癌及其相應的正常涎腺組織中RUNX3基因的甲基化狀態(tài)以及RUNX3基因啟動子CpG島第1-10位點中各位點的甲基化狀態(tài)，用LogisticANOVA模型分析烈RUNX3基因及各位點甲基化在涎腺腺樣囊性癌中發(fā)生的危險度，并比較RUNX3基因啟動子甲基化與腺樣囊性癌臨床病理因素之間的相關性。同

7、時用Westernblot法檢測19例經(jīng)過qMSP檢測的腺樣囊性癌及其匹配的正常涎腺組織中RUNX3蛋白的表達，以分析RUNX3基因啟動子甲基化對蛋白表達的影響。 第三章：RUNX3在涎腺腺樣囊性癌和正常涎腺中的表達及與患者預后的相關性 涎腺腺樣囊性癌患者的遠期預后較差。目前的一些研究認為外科切緣陽性、臨床分期、病理類型、神經(jīng)侵犯等是腺樣囊性癌患者的一個預后因素。同時，在分子水平一些研究者認為一些增殖或凋亡相關基因與腺樣

8、囊性癌患者的預后相關。RUNX3作為在胃癌中新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其表達的沉默與胃癌的發(fā)生和發(fā)展及遠處轉移有著高度的相關性，而且也影響著胃癌的治療效果和預后，因此檢測惡性腫瘤中RUNX3的表達可能提供一個比較好的預后指標。由于腺樣囊性癌患者出現(xiàn)遠處轉移是導致其預后差的一個主要因素，雖然在涎腺腺樣囊性癌中沒有關于RUNX3表達的報道，基于RUNX3與腫瘤遠處轉移的相關性，探討RUNX3在ACC中的表達對判斷該腫瘤的發(fā)生進展和預后都將有一個

9、參考作用。 試驗三分別用熒光定量qRT—PCR、Westernblot和免疫組織化學檢測RUNX3在正常涎腺和腺樣囊性癌中的表達 從液氮中取出9例正常涎腺(包括3例腮腺、2例舌下腺及2例頜下腺)和7例腺樣囊性癌組織，分別以熒光定量RT—PCR和Westernblot，檢測RUNX3mRNA和蛋白的表達情況。qRT—PCR結果以標準曲線法測定RUNX3mRNA的相對表達量。Westernblot結果用Image—ProPl

10、us軟件進行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值進行標準校正，計算RUNX3蛋白產(chǎn)物的相對量。同時用免疫組織化學檢測73例石蠟包埋的腺樣囊性癌組織中RUNX3蛋白在腫瘤細胞中的定位表達情況。 試驗四分析RUNX3表達與腺樣囊性癌臨床病理指標和預后的相關性 以Image—ProPlus圖像分析軟件檢測RUNX3蛋白在73例腺樣囊性癌中的表達水平，并以Tertile法將其分為高表達組(≥14.91％)、中表達組(6.94％-1

11、4.91％)和低表達組(≤6.94％)，并分析RUNX3的表達水平與73例腺樣囊性癌的臨床病理指標的相關性。同時以Cox回歸模型評價各臨床病理指標與預后的相關性，以Kaplan—Meier生存曲線檢測RUNX3表達水平對患者預后的影響，從而評估RUNX3在涎腺腺樣囊性癌中的表達對評價患者的預后的臨床價值． 結論： 1．RUNX3在腺樣囊性癌細胞株ACC-2和ACC-3中存在表達，而在肺高轉移腺樣囊性癌細胞株ACC—M中則

12、無表達。經(jīng)過300nmol/L的5─Aza—dc處理72小時后能提高RUNX3在這些細胞株中的表達。 2．人涎腺腺樣囊性癌中RUNX3基因甲基化的概率顯著高于正常涎腺組織，提示RUNX3基因啟動子CpG島甲基化是人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生的一個重要因素。 3．RUNX3基因CpG島的甲基化的規(guī)律是從5’區(qū)向轉錄起始點方向演進，轉錄起始點的甲基化程度最低，提示該位點為RUNX3基因甲基化的關鍵位點。 4．RUNX3基因C