LTB4在THP-1源性巨噬細(xì)胞中通過MAPK途徑上調(diào)EMMPRIN的表達.pdf

1、背景:
　　 目前急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)已成為我國城市和農(nóng)村人口死亡的主要原因之一，且發(fā)病率有逐年增高的趨勢。急性冠脈綜合征包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstableangina pectoris，UAP)、心源性猝死，死亡率較高。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)與急性冠脈綜合征的發(fā)生密

2、切相關(guān)。冠狀動脈粥樣硬化是一種血管壁的炎癥進展性疾病，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶不斷聚集，使斑塊的纖維帽降解，引起斑塊不穩(wěn)定，不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致急性冠脈綜合征的一個重要原因。
　　 白三烯B4(LTB4)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中是一種功能強大的趨化因子和炎癥介質(zhì)，它是花生四烯酸通過5-脂氧合酶（5-LO）的作用產(chǎn)生的炎性脂質(zhì)介質(zhì)。ERK信號通路阻滯劑PD98059能顯著降低LTB4的抗凋亡作用。白

3、三烯能上調(diào)斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotenase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotenase-9，MMP-9）表達，進而導(dǎo)致動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定、破裂。
　　 EMMPRIN（細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子）也稱為CD147，是一種有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的跨膜糖蛋白，它最初在許多腫瘤細(xì)胞的表面上被發(fā)現(xiàn)，能在成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞上誘導(dǎo)MMPs合成，很多研究證

4、實，在動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(SMC)上都可發(fā)現(xiàn)EMMPRIN高度表達，也可以增加血小板活性，促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。在不同時間段用NIM811抑制EMMPRIN后發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達量顯著減少，同樣的，在泡沫細(xì)胞中，EMMPRIN的增加使MMP-9的表達量顯著增加，EMMPRIN在動脈粥樣硬化斑塊中和載脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠中被發(fā)現(xiàn)高表達，這些結(jié)果表明，E刪PRIN在促進動脈粥樣硬化斑

5、塊不穩(wěn)定的過程中起著重要的作用。
　　 到目前為止，三種不同的絲裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK)已經(jīng)被確定，即ERK1/2、P38、JNK/SAPK。許多研究證實，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在炎癥方面起著重要的作用。
　　 國內(nèi)外研究和我們前期研究均顯示LTB4能增加MMPs的表達，但是否通過MAPKs途徑增加EMMPRIN表達，進而增加MMPs的表達，國內(nèi)外研究尚未有直接證據(jù)。
　　 目的：
　　

6、 探討白三烯B4在MAPK信號通路中對細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)表達的影響。
　　 方法：
　　 細(xì)胞培養(yǎng)人類單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清，10mM HEPES。
　　 細(xì)胞處理在2-6組THP-1細(xì)胞中加入終濃度為100nM的PMA，在37℃，5％CO2環(huán)境中繼續(xù)孵育24h，使懸浮生長的單核細(xì)胞分化成貼壁生

7、長的巨噬細(xì)胞。4-6組分別加入終濃度為20uM的PD98059，SB203580，SP600125培養(yǎng)箱孵育1小時后3-6組分別加入終濃度為100nM的LTB4，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育24h。
　　 明膠酶譜法(gelatinzymography)測定MMP-9的活性MMP-9為EMMPRIN的下游產(chǎn)物，通過MMP-9的活性變化來反映EMMPRIN的表達變化。6組分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液各10ul與上樣緩沖液混合，經(jīng)含0.1％明膠的SDS凝

8、膠行非變性垂直電泳(120V，100min)，至溴酚藍(lán)跑至底部，膠置2.5％TritonX-100中室溫震蕩孵育15min×2次。換用孵育液(0.05M Tris-HCl PH8.8，5mMCaCl，0.02％NaN3)，37℃中孵育16-20h，使用0.1％(w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色30-40min，脫色液[甲醇-冰醋酸-水(45∶10∶45)]脫色。
　　 RNA抽提和RT-PCR半定量分析用Trizol試劑提取總

9、RNA，加入隨機引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以cDNA為模板，PCR分別擴增EMMPRIN、MMP-9，設(shè)β-actin作為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于BIO-RAD Gel2000凝膠成像儀上成像，Quantity One(BIO-RAD)軟件作半定量分析。（EMMPRIN，上游引物:5'-GGTCACAGGGCACCGCTGGCT-3'下游引物:5'-CGGCCTCCATGTTCAGGTTCTCAA-3'; M

10、MP-9，上游引物:5'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'下游引物:5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3';β-actin，上游引物:5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3'下游引物:5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3')蛋白抽提和Western blot分析細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷PBS(PH7.4)沖洗后，加入4℃預(yù)冷的RIPA裂解液和PMSF，在冰上裂解30-60min，4℃，12000r

11、pm離心30min，提取的蛋白進行BCA蛋白定量，與2×上樣緩沖液煮沸變性5min。在10％SDS-PAGE膠中每孔加入總蛋白20ug進行垂直電泳(120V，90min)，半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)轉(zhuǎn)膜(15V，38min)，5％脫脂牛奶-TBST室溫封閉2h，5％脫脂牛奶-TBST稀釋EMMPRIN一抗(1∶1000)4℃輕搖過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育1.5h后用化學(xué)發(fā)光顯色劑(Amersham)顯色，感光、洗片。將所得照片

12、掃描，輸入計算機，用Quantity one軟件掃描得吸光度值，以EMMPRIN、β-actin平均吸光度比值做定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.THP-1細(xì)胞的上清液中MMP-9的活性極其微弱，幾乎沒有，THP-1細(xì)胞經(jīng)過PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后MMP-9活性明顯增加，但是加入LTB4的巨噬細(xì)胞組（3組）與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組（2組）相比，MMP-9活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，加入PD98059阻斷ERK1/

13、2通路后，MMP-9的活性較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SB203580阻斷P38通路后，MMP-9的活性較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SP600125后阻斷JNK通路后，MMP-9的活性較第3組明顯減少(p＜0.05)。
　　 2.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后，EMMPRIN的mRNA表達量增加，但與1組相比，并無統(tǒng)計學(xué)差異，加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比，加入LTB4的巨噬細(xì)

14、胞組的EMMPRIN的mRNA表達量明顯增加(p＜0.05)，加入PD98059阻斷ERK1/2通路后，EMMPRIN的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SB203580阻斷P38通路后，EMMPRIN的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SP600125后阻斷JNK通路后，EMMPRIN的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.05)。
　　 3.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后，MMP

15、-9的mRNA表達量較THP-1細(xì)胞組明顯增加(p＜0.01)，加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比，加入LTB4的巨噬細(xì)胞組的MMP-9的mRNA表達量明顯增加(p＜0.01)，加入PD98059阻斷ERK1/2通路后，MMP-9的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SB203580阻斷P38通路后，MMP-9的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SP600125后阻斷JNK通路后，M

16、MP-9的mRNA表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)。
　　 4.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后，EMMPRIN的蛋白表達量較THP-1細(xì)胞組明顯增加(p＜0.01)，加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比，加入LTB4的巨噬細(xì)胞組EMMPRIN的蛋白表達量明顯增加(p＜0.01)，加入PD98059阻斷ERK1/2通路后，EMMPRIN的蛋白表達量較第3組明顯減少(p＜0.01)，加入SB20358