應用四聚體技術檢測肺結核患者外周血及病變組織C5特異性CD4+T淋巴細胞.pdf

1、研究背景:
　　結核病是可侵犯全身組織器官的慢性傳染病，尤其以肺部感染多見，病原體為結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。隨著卡介苗的普遍接種及抗結核藥物的應用，結核病的感染率、發(fā)病率和死亡率曾大幅下降。近年來，由于人口流動增多、耐藥菌株的流行、結核菌與人體免疫缺陷病毒（HIV）的雙重感染以及許多國家結核病控制力度的薄弱，導致全球結核病疫情回升。機體的抵抗力，侵入機體的細菌數(shù)量，細菌毒力的大

2、小，共同決定了感染者是否發(fā)病。結核分枝桿菌屬胞內(nèi)感染菌，機體的抗結核免疫主要依靠T淋巴細胞，特別是以CD4+Thl細胞為主的細胞免疫。機體感染結核分枝桿菌后，抗原遞呈細胞（antigen present cells，APCs），主要是單核巨噬細胞對其吞噬，加工處理，抗原肽結合APCs表面的人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA），形成多肽／HLA復合物，然后被T淋巴細胞表面的T細胞受體（T-lymphoc

3、yte receptor,TCR）特異性地識別并結合，進而介導一系列的免疫反應。利用多肽/MHC與TCR的特異性結合的特性，許多學者考慮采用免疫標記技術標記多肽/MHC去檢測表達有TCR分子的多肽特異性T淋巴細胞。但由于多肽/MHC單體與CD4+T淋巴細胞的TCR結合親和力低，解離速度很快，不能直接用來檢測抗原特異性T淋巴細胞。1996年，Altman等成功創(chuàng)建了多肽/MHC四聚體技術，從而大大提高了多肽/MHC復合物與TCR的親和力和

4、穩(wěn)定性，使這一難題得到解決。
　　目前，多肽／MHC I四聚體己被廣泛用于抗原特異性CTL活性檢測，而且可應用于免疫學研究和檢測、免疫治療以及疫苗療效監(jiān)測。傳統(tǒng)制備MHCI類分子四聚體是用基因工程的方法，先分別制備β2m和可生物素化的重鏈（通過在其C端加上15個氨基酸的BirA酶底物肽），然后二者和特異性抗原肽共同孵育，形成MHC-肽復合物單體。經(jīng)過BirA酶作用后，生物素化的MHC-肽復合物單體與鏈霉親和素按4：l的比例結合，形

5、成MHCⅠ-肽四聚體。然而，MHCⅡ類分子（DR）是由α鏈和β鏈形成的異二聚體，由于α、β兩條鏈都具有多態(tài)性，體外折疊時通常不能很好的結合短肽，因此，制備MHCⅡ類分子的四聚體要復雜得多。根據(jù)Novak的研究，在α、β鏈的C端連上連接蛋白和亮氨酸拉鏈基序，且β鏈上加上可生物素化的底物肽。經(jīng)大量表達、分離純化和生物素化后，在體外與高濃度的特異性多肽37℃孵育72小時，形成多肽/MHCⅡ-肽復合物，最后與熒光素標記的鏈霉親和素結合形成四聚體

6、。
　　在實驗室前期，已構建了16株能分泌表達不同C5/HLA-DRB1單體的果蠅S2恒定細胞株，本次實驗研究應用了其中2株(C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）。C5是來源于CFP10中的一段氨基酸序列，本實驗室之前的研究通過用ELISPOT等方法已經(jīng)證實了C5是一種廣譜HLA-DR限制性的CD4+ T淋巴細胞反應性多肽。而HLA-DRB1*090102和HLA-DRB1*130201為H

7、LA-DRB1基因座的兩種不同等位基因序列，分別編碼不同的HLA-DRB1分子。
　　研究目的:
　　1.應用已制備的四聚體，結合激光共聚交顯微鏡在結核組織中觀察C5特異性CD4+T淋巴細胞。
　　2.應用已制備的四聚體，結合流式細胞技術檢測C5特異性CD4+T淋巴細胞在結核患者外周血單個核細胞中的比例。
　　研究內(nèi)容和方法
　　應用已有的果蠅S2恒定細胞株，分別表達、純化獲得2種生物素化C5/HLA-DR

8、B1（C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）復合物單體，通過SDS-PAGE和Dot blot進行鑒定，證實為目的單體蛋白后，制備FITC標記的四聚體，分別與鼠抗人CD4共染色，對肺結核患者的肺組織切片進行原位染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察C5特異性四聚體陽性CD4+ T淋巴細胞的分布，以肺炎組織切片作對照染色；制備成相應PE標記的四聚體，分別與抗人CD4-FITC共染色，流式細胞技術分析檢測肺結核患

9、者外周血C5特異性CD4+ T淋巴細胞，同時以健康成人及非結核呼吸道感染患者外周血作為研究對照，然后采用SSPS16.0統(tǒng)計軟件進行Wilcoxon秩和檢驗。
　　結果:
　　1.本實驗通過誘導可分泌表達生物素化的C5／HLA-DRB1復合物單體的細胞株，經(jīng)純化、濃縮得到C5／HLA-DRB1復合物單體蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE鑒定兩種單體蛋白與目的蛋白的分子量大小一致，Dot blot鑒定證實兩種單體蛋白均為生物素化的αβ

10、鏈的二聚體。2種C5／HLA-DRB1四聚體：l3號：C5／HLA-DRB1*090102、14號：C5／HLA-DRB1*130201均為目的蛋白單體。
　　2.應用2種四聚體用原位染色來檢測病理組織切片，可直接觀察到組織中針對C5特異性CD4+T淋巴細胞的比例、在組織中的定位及分布情況。觀察整個肺結核病變組織切片后均能發(fā)現(xiàn)C5特異性CD4+T淋巴細胞，而肺炎病理切片對照中，未發(fā)現(xiàn)C5特異性CD4+T淋巴細胞。
　　3.應

11、用C5/HLA-DRB1*090102四聚體檢測肺結核組、非結核呼吸道感染組和健康成人組的C5特異性CD4+T淋巴細胞的中位數(shù)分別為0.15％、0.09%、0.03%，而應用C5/HLA-DRB1*130201四聚體則分別為0.19%、0.10%、0.04%，肺結核患者組外周血C5特異性CD4+T淋巴細胞的中位數(shù)高于對照組（p﹤0.05），2種四聚體之間的檢測結果無顯著性差別（p﹥0.05）。
　　結論:
　　1．誘導果蠅S