分化抑制蛋白ID和HIV-1整合酶抑制劑的結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究.pdf

1、第一部分
　　目的：分化抑制蛋白（Id）家族在細(xì)胞增殖、分化、以及腫瘤發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中均有重要作用。本研究對(duì)該家族蛋白的N端序列進(jìn)行保守性結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建其基因突變體。
　　方法：應(yīng)用ClustalX(1.81)軟件對(duì)Id蛋白家族中三個(gè)成員（Id1-3）的N端序列進(jìn)行同源性分析；Swiss-PdbViewer3.7(SP5)軟件模擬高同源區(qū)域中關(guān)鍵性氨基酸突變前后的三維結(jié)構(gòu)模型；以PCR方法將突變點(diǎn)引入Id序列，通過(guò)重疊PCR方

2、法擴(kuò)增出全長(zhǎng)編碼序列；酶切與測(cè)序確證突變序列的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：Id1-3蛋白的N端存在一個(gè)由11個(gè)氨基酸形成的高度保守的旋轉(zhuǎn)-螺旋（Loop-Helix）結(jié)構(gòu)，將其中最保守的絲氨酸與亮氨酸分別突變?yōu)楦拾彼崤c纈氨酸；成功構(gòu)建包含突變Id基因序列的pGEX原核表達(dá)載體。
　　結(jié)論：本研究在Id1-3蛋白N端識(shí)別了一個(gè)保守的Loop-Helix結(jié)構(gòu)，為深入研究其協(xié)同的功能特征提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)；構(gòu)建的突變其中的絲氨酸表達(dá)載體為研究

3、Id蛋白磷酸化修飾和功能奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　目的：兒茶素家族化合物作為一種毒副作用小、價(jià)格低廉的天然化合物，已顯示出對(duì)艾滋病毒的抑制效果，但其抑制機(jī)理仍不明確。本研究探討兒茶素家族化合物對(duì)于HIV-1整合酶的抑制效果，初步闡明該家族化合物對(duì)艾滋病毒的抑制機(jī)理。
　　方法：采用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)四種帶有沒(méi)食子酰基的兒茶素對(duì)于HIV-1整合酶的抑制力。將這四種兒茶素按照等比例混合，檢測(cè)它們協(xié)同抑制的效果，同時(shí)

4、選擇一種無(wú)沒(méi)食子?；膬翰杷谽C作為對(duì)照。采用分子對(duì)接的計(jì)算機(jī)模擬方法研究沒(méi)食子酰基的兒茶素對(duì)于HIV-1整合酶的抑制機(jī)理。
　　結(jié)果：通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)四種含有沒(méi)食子酰基的兒茶素，包括Catechingallate(CG)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG），Gallocatechingallate(GCG)，和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epicatechingallate,

5、ECG）對(duì)HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。通過(guò)分子對(duì)接的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HIV-1整合酶沒(méi)有結(jié)合病毒DNA的時(shí)候，這四種兒茶素會(huì)結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，因此改變了整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低了整合酶的活性。此外，當(dāng)整合酶與病毒DNA結(jié)合上之后，這四種兒茶素可以結(jié)合在整合酶與病毒DNA之間，從而干擾其整合效率。并且，這四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定的四種藥物的

6、混合物對(duì)整合酶的半數(shù)抑制濃度（IC50=0.1μmol/L）優(yōu)于已用于臨床的整合酶抑制劑raltegravir。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)四種含沒(méi)食子?；?CG、EGCG、GCG，ECG)的兒茶素對(duì)HIV-1整合酶有顯著的抑制效果,其作用機(jī)制為兒茶素結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，改變整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低整合酶的活性。四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，其混合物對(duì)整合酶的半數(shù)抑制濃度為（IC

7、50=0.1μmol/L），表明含沒(méi)食子?；膬翰杷赜型蔀橐环N新的HIV-1整合酶抑制劑。
　　第二部分：
　　目的：分化抑制蛋白（Id）家族在細(xì)胞增殖、分化、以及腫瘤發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中均有重要作用。對(duì)該家族蛋白的N端序列進(jìn)行保守性結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建其基因突變體。
　　方法：應(yīng)用ClustalX(1.81)軟件對(duì)Id蛋白家族中三個(gè)成員（Id1-3）的N端序列進(jìn)行同源性分析；Swiss-PdbViewer3.7(SP5)軟件模

8、擬高同源區(qū)域中關(guān)鍵性氨基酸突變前后的三維結(jié)構(gòu)模型；先用PCR方法將突變點(diǎn)引入Id序列，再通過(guò)重疊PCR方法擴(kuò)增出全長(zhǎng)編碼序列；酶切與測(cè)序確證突變序列的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：Id1-3蛋白的N端存在一個(gè)由11個(gè)氨基酸形成的高度保守的旋轉(zhuǎn)-螺旋（Loop-Helix）結(jié)構(gòu)，將其中最保守的絲氨酸與亮氨酸分別突變?yōu)楦拾彼崤c纈氨酸；將突變后的Id基因序列重組到pGEX原核表達(dá)載體中。
　　結(jié)論：本研究在Id1-3蛋白N端識(shí)別了一個(gè)保守的

9、Loop-Helix結(jié)構(gòu)，為深入研究其協(xié)同的功能特征提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)；突變其中的絲氨酸為研究Id蛋白潛在的磷酸化修飾及相應(yīng)功能特征的改變奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：
　　目的：兒茶素家族化合物作為一種毒副作用小，價(jià)格低廉的天然化合物已經(jīng)體現(xiàn)出了對(duì)艾滋病毒的抑制效果，但其抑制機(jī)理仍不明確。為此研究了兒茶素家族化合物對(duì)于HIV-1整合酶的抑制效果，闡述了該家族化合物對(duì)艾滋病毒的抑制機(jī)理。
　　方法：我們采用了ELISA實(shí)驗(yàn)方

10、法檢測(cè)四種帶有沒(méi)食子?；膬翰杷貙?duì)于HIV-1整合酶的抑制力。并且我們還將這四種兒茶素按照等比例混合，檢測(cè)它們協(xié)同抑制的效果。此外，我們選擇了一種最主要的不帶沒(méi)食子?；膬翰杷谽C，作為對(duì)照。我們還采用了分子對(duì)接的計(jì)算機(jī)模擬方法研究了帶有和不帶有沒(méi)食子?；膬翰杷貙?duì)于HIV-1整合酶的抑制機(jī)理。
　　結(jié)果：通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)四種含有沒(méi)食子酰基的兒茶素，包括Catechingallate(CG)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（

11、Epigallocatechingallate，EGCG），Gallocatechingallate(GCG)，和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epicatechingallate,ECG）對(duì)HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。通過(guò)分子對(duì)接的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HIV-1整合酶沒(méi)有結(jié)合病毒DNA的時(shí)候，這四種兒茶素會(huì)結(jié)合在Tyr143和Gln148氨基酸上，因此改變了整合酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Gly140-Gly149）的柔韌性，從而降低了整合酶的活性。此外，當(dāng)整合

12、酶與病毒DNA結(jié)合上之后，這四種兒茶素可以結(jié)合在整合酶與病毒DNA之間，從而干擾其整合效率。并且，這四種兒茶素具有很高的協(xié)同抑制效果，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定的四種藥物的混合物對(duì)整合酶的半數(shù)抑制濃度（IC50=0.1μmol/L）優(yōu)于已用于臨床的整合酶抑制劑raltegravir。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)四種含有沒(méi)食子?；膬翰杷?，包括CG、EGCG、GCG，ECG對(duì)HIV-1整合酶有顯著的抑制效果。其作用機(jī)制為四種兒茶素結(jié)合在Tyr1