穩(wěn)定過表達(dá)BAALC基因的人白血病細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性白血病(AL)為一組造血系統(tǒng)惡性疾病,是我國的十大惡性腫瘤之一,是青少年和35歲以下成年人發(fā)病率最高的惡性腫瘤。目前對AL發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確。盡管隨著化療方案的改善,AML完全緩解(CR)率可達(dá)70％左右,但大部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā),一旦復(fù)發(fā),預(yù)后差。難治復(fù)發(fā)是目前導(dǎo)致.AML治療失敗的最根本因?yàn)?因此深入研究急性白血病發(fā)生和發(fā)展(難治復(fù)發(fā))的分子機(jī)制是非常重要的。研究表明AL的發(fā)生和發(fā)展是多種相關(guān)基因表達(dá)

2、失?；?和抑癌基因失活所致,正?；蛲蛔兓蛉笔?、癌基因的異常擴(kuò)增和表達(dá)、耐藥基因的表達(dá)增加、凋亡基因受抑、基因本身的多效性以及多個基因的協(xié)同作用和機(jī)體免疫因素,決定最終白血病發(fā)生和發(fā)展。
　　 近幾年發(fā)現(xiàn)腦和急性白血病胞漿(BAALC)基因與AL的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,是正常核型AML(NC-AML)患者最有意義的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)之一。有研究發(fā)現(xiàn)BAALC基因在部分AML、ALL和CML急變期(CML-BP)患者高表達(dá),而

3、在CML慢性期(CML-CP)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)不表達(dá),因此推測BAALC基因可能與AML和ALL發(fā)生密切相關(guān)。有研究報道正常核型AML患者中70％存在BAALC基因顯著高表達(dá),且BAALC表達(dá)量與NC-AML預(yù)后關(guān)系密切,BALLC表達(dá)量越高,AML患者預(yù)后越差,BAALC高表達(dá)的AML患者其無病生存期(DFS)和總生存期(OS)明顯縮短。多變量分析也表明,BALLC是獨(dú)立于FLT-ITD、MLL-TD外的,在NC-AML

4、中最具意義的預(yù)后因素之一,與低表達(dá)病例相比,耐藥率、累計復(fù)發(fā)率明顯增高,死亡的危險度高2.7倍。我們前期工作通過實(shí)時定量PCRq(RQ-PCR)技術(shù)檢測.AML患者BAALC基因的表達(dá),也發(fā)現(xiàn)大部分初治AML可出現(xiàn)BAALC的高表達(dá),而正常對照組未檢出BAALC的表達(dá),正常核型初治AML高表達(dá)BAALC者化療CR率顯著低于低表達(dá)者,OS更短,預(yù)后更差。
　　 由于BAALC與AL的研究尚處于起步階段,目前關(guān)于BAALC基因和蛋白

5、的功能、BAALC在AL發(fā)病和難治復(fù)發(fā)中作用的分子機(jī)制、上下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其信號傳導(dǎo)通路尚未清楚,有關(guān)BAALC基因在AL細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)對AL細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　 研究目的:
　　 通過基因工程技術(shù)在體外構(gòu)建pMSCV-BAAI。C表達(dá)載體,并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將該表達(dá)載體導(dǎo)入人白血病細(xì)胞株中,建立穩(wěn)定表達(dá)的BAALC基因的人白血病細(xì)胞株,并進(jìn)一步研究BAALC基因過表達(dá)對人白血病細(xì)胞株生物學(xué)

6、行為的影響。
　　 研究方法:
　　 1.從KASUMI-1細(xì)胞株中提取mRNA,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增BAALC1-6-8獲得目的基因片段,選用pMDTM 18-T Vector做TA克隆。分別雙酶切TA克隆獲得的陽性質(zhì)粒和pcDNATM3.1/myc-His A質(zhì)粒,瓊脂糖電泳純化回收前者的小片段和后者的大片段,應(yīng)用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。PCR擴(kuò)增BAALC-his基因序列,雙酶切PCR產(chǎn)

7、物和pMSCV載體,T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中,挑選陽性克隆,構(gòu)建pMSCV-BAALC表達(dá)載體,應(yīng)用PCR、雙酶切及測序等方法進(jìn)行鑒定。
　　 2.重組載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入不表達(dá)BAALC基因的人白血病細(xì)胞株(HL60/ADM、Molt-4和K562)中,Puro抗性篩選獲得陽性克隆細(xì)胞株,從而獲得穩(wěn)定過表達(dá)BAALC基因的白血病細(xì)胞株。提取總RNA和總蛋白,分別行RT-PCR和Western blo

8、t驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后BAALC基因在三種白血病細(xì)胞株中表達(dá)情況。
　　 3.擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)BAALC基因的HL60/ADM細(xì)胞株,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測BAALC基因?qū)L60/ADM細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS 13.0軟件包處理,P≤0.05表示差異有顯著性意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、重組質(zhì)粒pMSCV-BAALC后,用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙

9、酶切及BAALC-A/S引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物,雙酶切產(chǎn)物在5.9kb和535bp處各見一清晰的條帶,其中535bp處的條帶與PCR擴(kuò)增BAALC片段大小相當(dāng),初步證實(shí)BAALC基因已連接到pMSCV表達(dá)載體上。根據(jù)pMSCV表達(dá)載體上下游引物序列,正向(5'→3')測序結(jié)果經(jīng)核對后,證實(shí)基因插入準(zhǔn)確無誤。
　　 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況,可見部分細(xì)胞呈GFP陽性,轉(zhuǎn)染48h收集細(xì)胞,PBS洗滌后以流式細(xì)

10、胞術(shù)(FACS)檢測GFP表達(dá)情況,并計算最佳轉(zhuǎn)染效率。
　　 3、RT-PCR檢測HL60/ADM、MOLT-4和K562細(xì)胞株及其各自轉(zhuǎn)染pMSCV空載體和pMSCV-BAALC重組載體的穩(wěn)定細(xì)胞株的BAALC基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示,三種細(xì)胞株均能表達(dá)穩(wěn)定的GAPDH基因,根據(jù)pMSCV表達(dá)載體的特點(diǎn),我們設(shè)計了針對位于pMSCV的5'LTR和3'LTR序列之間的PGK基因片段的引物,檢測pMSCV的5'LTR和3'LTR序

11、列之間基因表達(dá)情況,結(jié)果可見,HL60/ADM、MOLT-4和K562細(xì)胞株沒有PGK基因序列的表達(dá),但轉(zhuǎn)染pMSCV空載體和pMSCV-BAALC重組載體的細(xì)胞株均有很強(qiáng)的PGK序列表達(dá),BAALC基因在HL60/ADM、MOLT-4和K562細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染pMSCV空載體組均沒有表達(dá),而在轉(zhuǎn)染pMSCV-BAALC重組載體組表達(dá)較強(qiáng)。同時選取KASUMI-1細(xì)胞株為陽性對照,可見轉(zhuǎn)染pMSCV-BAALC重組載體的細(xì)胞株與KASUMI

12、-1細(xì)胞株擴(kuò)增出來的BAALC基因片段大小相當(dāng)。
　　 4、Western blot檢測轉(zhuǎn)染BAALC基因前后細(xì)胞表達(dá)BAALC蛋白情況。結(jié)果顯示在導(dǎo)入pMSCV-BAALC重組載體后,BAALC蛋白均能在HL60/ADM、MOLT-4和K562細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá),提示重組載體能充分發(fā)揮過表達(dá)作用,表明已成功建立了穩(wěn)定表達(dá)BAALC基因的三種人白血病細(xì)胞株。
　　 5、細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果提示,HL60/ADM、HL60/ADM

13、+pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞均以異常早幼粒細(xì)胞為主,細(xì)胞核質(zhì)比較大,胞漿染藍(lán)色,染色質(zhì)呈顆粒狀,但HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞多核細(xì)胞比例增高(雙核、四核)。提示HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞較其他兩種細(xì)胞增殖快,惡性程度高。
　　 6、MTT結(jié)果顯HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+pMSCVBAALC細(xì)胞的增殖率存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=25

14、4.832,P=0.000),結(jié)合多重比較結(jié)果顯示,HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞株的增殖率(均數(shù)0.563)顯著高于HL60/ADM細(xì)胞株(均數(shù)0.479)和HL60/ADM+pMSCV細(xì)胞株(均數(shù)0.450),(P分別為0.044和0.009)；而HL60/ADM細(xì)胞株和HL60/ADM+pMSCV細(xì)胞株的增殖率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.891)。
　　 7、Annexin V/PI檢測凋亡細(xì)胞比例的結(jié)果顯

15、示:HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC 3種細(xì)胞間的凋亡細(xì)胞比例存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=124.437,P=0.000),結(jié)合多重比較結(jié)果顯示HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞株的凋亡比率(均數(shù)18.618)顯著低于HL60/ADM(均數(shù)44.205)和HL60/ADM+pMSCV細(xì)胞株(均數(shù)43.952)(P均為0.017)；而HL60/ADM+pMSCV細(xì)胞株的凋亡比率與H

16、L60/ADM細(xì)胞株比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P=1.000)。
　　 8、As2O3濃度為1μg/ml分別作用于HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞株24h后,發(fā)現(xiàn)HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞株的(G0+G1)期、G2期均較HL60/ADM和HL60/ADM+pMSCV細(xì)胞株明顯延長,而HL60/ADM+pMSCV-BAALC細(xì)胞株的S期較HL60/ADM、H