棉鈴蟲P450基因CYP9A12和CYP9A17的功能表達(dá)與擬除蟲菊酯代謝.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hubner)屬于鱗翅目夜蛾科實(shí)夜蛾亞科棉鈴蟲屬，是一種世界性的重要經(jīng)濟(jì)害蟲。棉鈴蟲對殺蟲劑的抗性以及對植物防御物質(zhì)的適應(yīng)性是人們長久以來密切關(guān)注的重要問題。細(xì)胞色素P450是一類龐大的基因家族，它幾乎存在于所有的生物體中。棉鈴蟲體內(nèi)的細(xì)胞色素P450關(guān)系到它的生長發(fā)育以及對外界環(huán)境的適應(yīng)性，具有重要的生物學(xué)意義。屬于CYP9和CYP6家族的多個P450基因的過量表達(dá)與棉鈴蟲對外來化合物的

2、解毒代謝有關(guān).本文對棉鈴蟲細(xì)胞色素P4509家族基因CYP9A12和CYP9A17v2進(jìn)行了表達(dá)及功能方面的研究，同時構(gòu)建了棉鈴蟲細(xì)胞色素P4506家族基因CYP687和CYP6AE14酵母表達(dá)載體。 一、田間棉鈴蟲P450基因(CYP9A12和CYP9A17v2)mRNA差異表達(dá) 以EF-1α作為參照基因，采用半定量RT-PCR的方法比較了棉鈴蟲江浦種群六齡幼蟲中腸、脂肪體和雌雄蛹、雌雄成蟲中CYP9A12、CYP9A

3、17v2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明：CYP9A12和CYP9A17v2在中腸中的表達(dá)量均高于脂肪體中的表達(dá)量，CYP9A17v2在棉鈴蟲中腸和脂肪體中的表達(dá)量要高于CYP9A12在相應(yīng)組織中的表達(dá)量。CYP9A12和CYP9A17v2 mRNA在蛹期和成蟲期不表達(dá)或表達(dá)量極低。 二、棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因外源表達(dá)產(chǎn)物對擬除蟲菊酯類藥劑的代謝 細(xì)胞色素P450氧化酶解毒代謝作用增強(qiáng)是棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類藥劑產(chǎn)生抗性的

4、主要原因，棉鈴蟲細(xì)胞色素P450氧化酶基因CYP9A12,CYP9A17v2的組成型過量表達(dá)與擬除蟲菊酯抗性相關(guān).以pYES2作為表達(dá)載體，在酵母W(R)菌株中表達(dá)了棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v2，分析了這兩個基因的異源表達(dá)產(chǎn)物對溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯和聯(lián)苯菊酯四種擬除蟲菊酯類藥劑的離體代謝作用，代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：含有CYP9A12外源基因的重組酵母細(xì)胞裂解液對溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯的代謝率

5、分別為8.58 pmol deltamethrin/min/mg protein，5.85 pmolcyhalothrin/min/mg protein，3.94 pmol bifenthrin/min/mg protein；含有CYP9A17v2外源基因的重組酵母細(xì)胞酶液對溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的代謝率分別為9.06 pmoldeltamethrin/min/mg protein，5.61 pmol cyhalothrin/min/mg

6、 protein；各重組酵母細(xì)胞裂解液均檢測不到對甲氰菊酯的代謝。 三、棉鈴蟲細(xì)胞色素P450(CYP6B7、CYP6AE14)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI上已經(jīng)登陸的CYP6家族序列設(shè)計特異性引物，從室內(nèi)氰戊菊酯抗性品系YGF中克隆出兩個CYP6家族(CYP687，CYP6AE14編碼區(qū)全長基因。測序結(jié)果表明：CYP687和CYP6AE14編碼區(qū)長分別為1512bp和1578bp，分別編碼504和526個氨基酸。與