Ⅰ西洛他唑改善糖尿病大鼠腎臟炎癥及其機(jī)制研究Ⅱ中國漢族人群OCTN2基因多態(tài)性分布及相關(guān)研究.pdf

1、研究目的
　　 本研究在前期工作基礎(chǔ)上,采用空腹腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,觀察糖尿病大鼠腎臟病變,如腎臟肥大指數(shù)、尿微量蛋白、腎小球體積,并從分子、基因水平檢測。腎臟組織VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、VEGF表達(dá),轉(zhuǎn)錄因子NF-кB、PPARα、PPARγ表達(dá)和活性,及cAMP含量,同時觀察應(yīng)用西洛他唑治療后上述指標(biāo)的改變,以進(jìn)一步探討西洛他唑?qū)N的保護(hù)作用及可能機(jī)制。從而為糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制和臨床治療

2、提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù),也為西洛他唑新適應(yīng)癥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 健康雄性SD大鼠,以65 mg.kg-1鏈脲佐菌素腹腔注射誘發(fā)糖尿病。隨機(jī)將已制備成糖尿病模型的大鼠分為3組:糖尿病對照組15只,高劑量西洛他唑治療組13只；低劑量西洛他唑組13只。另設(shè)正常對照組共10只大鼠。
　　 連續(xù)治療8周后處死動物。收集處死前1天24h尿液測尿中微量白蛋白,并計(jì)算24h尿蛋白排泄率。取腎臟稱重,計(jì)算腎重/

3、體重。分離腎皮質(zhì),用于下列檢查:(1)HE染色觀察腎臟病理改變；(2)Western blotting檢測VCAM-1、ICAM-1蛋白表達(dá)；(3)RT-PCR、real-timePCR檢測VCAM-1、ICAM-1、PPARα、PPARγ基因表達(dá)；(4)ELISA檢測MCP-1、VEGF、cAMP含量；(5)凝膠電泳遷移率分析檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性。
　　 研究結(jié)果
　　 1.西洛他唑?qū)μ悄虿〈笫篌w重、血糖和HbA

4、lc水平無顯著影響。
　　 2.糖尿病大鼠腎重/體重較正常組明顯升高,西洛他唑有減輕腎臟肥大的趨勢。
　　 3.糖尿病組大鼠出現(xiàn)腎小球明顯肥大,有輕度炎細(xì)胞浸潤,腎小球毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚,系膜區(qū)增寬,細(xì)胞外基質(zhì)增多,近端腎小管上皮細(xì)胞腫脹并玻璃樣變性；低劑量西洛他唑治療后上述病理改變得到改善,腎小球系膜區(qū)增寬、基底膜增厚均減輕,腎小管變性減少；而高劑量西洛他唑治療后,幾乎恢復(fù)至正常狀態(tài)。
　　 糖尿病大鼠腎

5、小球體積比正常大鼠增加2.1倍,高、低劑量西洛他唑可使這種肥大分別減輕51％和38％,證實(shí)了西洛他唑?qū)μ悄虿〈笫竽I臟的保護(hù)作用。
　　 4.Western blotting結(jié)果顯示,糖尿病組VCAM-1表達(dá)較正常組升高近1倍高、低劑量西洛他唑可使VCAM-1表達(dá)分別下降40％和28％。糖尿病大鼠ICAM-1蛋白表達(dá)量較正常組升高1倍左右,西洛他唑可劑量性依賴性地降低糖尿病大鼠腎臟ICAM-1蛋白表達(dá)。
　　 5.既往RT

6、-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DM組VCAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯升高；各治療組較糖尿病組明顯降低,以高劑量組降低更明顯。
　　 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。糖尿病大鼠VCAM-1 mRNA表達(dá)是正常組的2倍,ICAM-1 mRNA表達(dá)為正常組的1.7倍；高、低劑量西洛他唑分別引起VCAM-1 mRNA表達(dá)下降43％和40％,使得ICAM-1 mRNA表達(dá)下降38％和25％。
　　 6.糖尿

7、病大鼠腎臟MCP-1含量明顯升高,為正常大鼠的2倍,西洛他唑明顯降低MCP-1含量,且高劑量降低效果比低劑量更顯著；VEGF含量與之類似,糖尿病大鼠為正常大鼠的1.6倍,VEGF水平下降趨勢隨西洛他唑劑量增加逐漸增高,即高劑量西洛他唑組下降最為明顯,低劑量組較弱。
　　 7.糖尿病大鼠腎臟組織細(xì)胞核內(nèi)NF-кB-DNA結(jié)合活性顯著升高,與正常組相比經(jīng)西洛他唑治療后NF-кB活性顯著下降。
　　 8.Peason相關(guān)性分析

8、顯示,VCAM-1 mRNA表達(dá)、ICAM-1 mRNA表達(dá)與NF-кB-DNA結(jié)合活性均呈明顯正相關(guān)。
　　 9.糖尿病大鼠腎臟PPARα、PPARγ mRNA表達(dá)均較正常組明顯下降,分別降低31％、34％；西洛他唑則顯著增加兩種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),且均呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 10.腎臟中cAMP含量在各組間差異無顯著性。
　　 結(jié)論
　　 我們的研究表明,西洛他唑?qū)μ悄虿∧I病的保護(hù)作用是通過抗炎機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

9、包括對炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性和PPARs表達(dá)的抑制,及其下游粘附分子VCAM-1、ICAM-1,趨化因子MCP-1,細(xì)胞因子VEGF表達(dá)減少。西洛他唑的抗炎作用與cAMP無關(guān)。
　　 上述結(jié)果為應(yīng)用西洛他唑治療糖尿病腎病提供了理論依據(jù)。
　　 研究目的
　　 藥物基因組學(xué)研究認(rèn)為,藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物作用受體或靶位等的基因變異是引起藥物反應(yīng)個體差異的根本因?yàn)?。繼藥物代謝酶、藥物作用靶位多態(tài)性研究之后

10、,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多態(tài)性在藥物處置中所起作用的研究正得到越來越多的重視。
　　 新型有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(novel organic cation transporters,OCTN)2為有機(jī)陽離子型藥物及內(nèi)源性物質(zhì)的新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在人體組織廣泛分布。生理作用為轉(zhuǎn)運(yùn)肉毒堿參與脂肪酸線粒體β-氧化,對維持心血管、神經(jīng)及生殖等系統(tǒng)正常功能具有重要的作用。OCTN2還參與多種藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),如β內(nèi)酰胺類抗生素、維拉帕米、螺內(nèi)酯、丙戊酸鹽、氟喹諾

11、酮類抗菌藥等。OCTN2基因變異可改變相應(yīng)藥物體內(nèi)藥動學(xué)過程,進(jìn)而造成藥物效應(yīng)的改變；也可引起OCTN2功能完全喪失,使肉毒堿自尿液排泄增多,引起致死性系統(tǒng)性肉毒堿缺乏；還可導(dǎo)致OCTN2轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變,單獨(dú)或與其他炎癥性腸病相關(guān)基因相互作用,增加Crohn's病、潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的危險性。
　　 迄今為止,已先后完成西方人種及日本人OCTN2基因突變測定,且證實(shí)某些SNPs與轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常有關(guān)。但占世界人口總數(shù)1/4的中國漢

12、族人群的相關(guān)研究尚未啟動。由于幾乎所有已知的轉(zhuǎn)運(yùn)體變異均呈種族依賴性,而難以將從某一種族獲得的數(shù)據(jù)運(yùn)用于另一種族。
　　 目前,檢測OCTN2基因變異的主要方法有RFLP、SSCP、DNA直接測序等,這些方法各有其局限性,未在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室得到應(yīng)用。變性高效液相色譜技術(shù)在篩查單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)或基因突變方面具有高通量、特異、敏感、高效、廉價等優(yōu)點(diǎn),尤為適用于大樣本量的未知突變篩查,在人類功能基因SNPs研究中已獲得良好的應(yīng)用。

13、>　　 本研究基于OCTN2在介導(dǎo)生理功能和藥理效應(yīng)中的重要作用,旨在查明OCTN2基因多態(tài)性在中國漢族健康人群中的分布特征,這將有助于豐富人類OCTN2基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫；有助于為藥物反應(yīng)個體差異提供分子水平的解釋,促進(jìn)個體化治療的實(shí)施；也有助于相關(guān)疾病發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測。
　　 本研究的另外一個目的是建立DHPLC方法檢測OCTN2基因變異的技術(shù)平臺,結(jié)合DNA測序法對中國漢族人群進(jìn)行OCTN2基因突變分析,從而為臨床提供一種快

14、速、高效、自動化的OCTN2基因變異檢測方法。
　　 研究方法
　　 收集92例中國漢族健康成年志愿者,其中男性49名,女性43名,平均年齡23±1.2歲。從外周血中抽提基因組DNA。針對OCTN2基因啟動子及1-10號外顯子設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用DHPLC技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行OCTN2基因突變篩查,通過峰形的差異對樣品基因型進(jìn)行區(qū)分,建立檢測OCTN2基因的PCR-DHPLC技術(shù)平臺。
　　 根據(jù)DHPLC

15、的分析結(jié)果,從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進(jìn)行DNA直接測序分析,以確認(rèn)變異樣本的基因型,并驗(yàn)證DHPLC方法的準(zhǔn)確性。
　　 研究結(jié)果
　　 1.PCR反應(yīng)共擴(kuò)增1012個片段,擴(kuò)增質(zhì)量高,且片段大小與預(yù)期目的片段一致。
　　 2.DHPLC篩查結(jié)果顯示在擴(kuò)增片段中出現(xiàn)雜合峰與純合峰兩種情況,單個色譜峰顯示為純合鏈,雙峰則表示是雜合異源雙鏈。共111個擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出雜合峰,提示有突變的異源雙鏈存在。
　

16、　 3.38例受試者第1外顯子發(fā)生變異,經(jīng)DNA測序驗(yàn)證為285T>C,為同義突變,變異發(fā)生頻率為41.3％。
　　 4.40例受試者第4外顯子發(fā)生變異,經(jīng)DNA測序驗(yàn)證為1071A>G,為同義突變,變異發(fā)生頻率為43.5％。
　　 38例受試者第4外顯子/內(nèi)含子接頭處發(fā)生變異,經(jīng)DNA測序驗(yàn)證為rs274557變異,發(fā)生頻率為41.3％。
　　 16例受試者同時存在上述2種變異,發(fā)生頻率為17.4％。

17、　　 5.11例受試者第10外顯子發(fā)生變異,經(jīng)DNA測序驗(yàn)證為3’端非翻譯區(qū)堿基缺失,發(fā)生頻率為12％。
　　 6.通過一系列DHPLC檢測前和檢測時各條件的摸索和優(yōu)化,初步建立了SLC22A5突變篩查的DHPLC檢測平臺；經(jīng)DNA直接測序證實(shí),DHPLC篩查基因突變準(zhǔn)確率在100％。
　　 結(jié)論及意義
　　 1.本研究系統(tǒng)地對OCTN2基因進(jìn)行了多態(tài)性位點(diǎn)的掃描,這是首次用較大樣本量在中國漢族人群中對OCTN

18、2基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行全面的掃描和分析,查明了中國漢族人群中基因變異情況,及變異發(fā)生頻率,有助于完善中國漢族人群OCTN2基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫,為指導(dǎo)華人個體化治療并進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)的檢測芯片打下了基礎(chǔ)。
　　 2.建立了檢測OCTN2基因的PCR-DHPLC技術(shù)平臺,為進(jìn)一步開展相關(guān)檢測提供了一種有效可行的方法。采用DHPLC技術(shù)篩查點(diǎn)突變其準(zhǔn)確性和敏感性都有較大優(yōu)勢,可以極大提高選擇性DNA測序的效率。DHPLC對于檢測新的點(diǎn)突變是