βB2-晶體蛋白基因敲除致白內(nèi)障機(jī)理研究.pdf

1、白內(nèi)障目前是世界上影響人類健康的常見病,是我國(guó)的第一位致盲疾病,發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,它的發(fā)生與多種因素有關(guān),是多種因素綜合作用的結(jié)果,比如晶體蛋白基因突變、氧化損傷、輻射、老化、葡萄糖、半乳糖等代謝障礙、脂質(zhì)過氧化物損傷等,發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是晶狀體發(fā)生混濁,影響光線經(jīng)過晶狀體的透射和折射,從而造成視物不清。 晶狀體位于瞳孔虹膜后方、玻璃體前方,含有高濃度蛋白質(zhì),其蛋白質(zhì)含量為晶狀體濕重的33％,主要包括晶狀體蛋白(crystal

2、lins)、膜蛋白(membrane protein)和細(xì)胞骨架蛋白(cytosteletal protein)。按溶水與否可分為可溶性蛋白(晶狀體蛋白)、非可溶性蛋白(膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、聚合的晶狀體蛋白)。其中可溶性蛋白即晶狀體蛋白主要為結(jié)構(gòu)蛋白,早期約占整個(gè)晶狀體蛋白質(zhì)的80～90％,它與周圍的細(xì)胞骨架蛋白相互結(jié)合,整齊排列,保持晶狀體的透光性。晶狀體蛋白根據(jù)其在電場(chǎng)中的相對(duì)遷移能力,主要分為α、β、γ三類晶體蛋白。晶狀體的透光

3、性取決于它所含的蛋白質(zhì)復(fù)雜有序的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的蛋白質(zhì)構(gòu)成。因此通過研究晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,能夠更好的闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。 目前α-對(duì)晶體蛋白的功能研究比較廣泛,它的分子伴侶作用已得到世界公認(rèn),其功能是介導(dǎo)其他蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配,在其他蛋白質(zhì)處于易感狀態(tài)時(shí),可保護(hù)其免受損傷,主要表現(xiàn)為抑制各種蛋白質(zhì)的聚集和酶的失活。對(duì)β-晶體蛋白的研究還比較少,其中βB2-晶體蛋白在β族晶體蛋白中含量最高,而且它的水溶性成份呈年齡依賴性增高

4、,因此,它的正常結(jié)構(gòu)及其水溶性成份水平,對(duì)維持晶狀體的高折射系數(shù)和透明至關(guān)重要。這種反常性增高勢(shì)必包含了它在維持晶狀體透光性中的重要作用,因此對(duì)于它的功能值得進(jìn)一步研究。 晶體蛋白基因敲除是研究晶體蛋白功能的一個(gè)重要手段,已有研究證明α-晶體蛋白基因敲除可以導(dǎo)致白內(nèi)障,而且α或β-晶體蛋白基因突變也可以導(dǎo)致白內(nèi)障。目前國(guó)內(nèi)外尚未有βB2-晶體蛋白基因敲除動(dòng)物模型的報(bào)道,因此我們選擇此蛋白作為靶點(diǎn),利用pB2-晶體蛋白基因敲除小鼠

5、模型,來研究該蛋白在維持晶狀體透明性中的作用。對(duì)白內(nèi)障的基礎(chǔ)研究已有一定的基礎(chǔ),本文主要通過觀察βB2-晶體蛋白基因敲除后對(duì)小鼠晶狀體生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響,并通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)晶體蛋白的功能,分析該蛋白在維持晶狀體透明以及在白內(nèi)障發(fā)病中的作用。 主要方法： 1.βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠模型的建立及鑒定 此部分工作是應(yīng)我室要求,與美國(guó)紐約iGTL實(shí)驗(yàn)室合作并最終在美國(guó)iGTL實(shí)驗(yàn)室完成,最后以饋贈(zèng)方式供我室專

6、用。小鼠品系為C57BL/C小鼠,小鼠模型為10只雜合子,已成功在本室進(jìn)行繁殖,子代小鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好,現(xiàn)已繁殖30余代。雜合小鼠繁殖的后代可以是雜合、純合或野生型。 取鼠尾末端組織,通過PCR技術(shù)對(duì)小鼠基因型進(jìn)行鑒定；取小鼠眼晶狀體進(jìn)行勻漿離心后取上清液,通過Western blot技術(shù)對(duì)晶體蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。鑒定后將小鼠分類飼養(yǎng)繁殖。 2.βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠晶狀體結(jié)構(gòu)和發(fā)育特征 定期用裂隙燈顯微

7、鏡觀察晶狀體的發(fā)育情況及白內(nèi)障的發(fā)生和演變過程。白內(nèi)障形成后,取出晶狀體經(jīng)過處理后用透射及掃描電子顯微鏡觀察晶狀體的超微結(jié)果。取各個(gè)鼠齡的小鼠晶體蛋白做雙向凝膠電泳檢測(cè)。定期測(cè)量小鼠體重、晶狀體濕重及其最大直徑,觀察βB2-晶體蛋白缺失對(duì)小鼠晶狀體生長(zhǎng)發(fā)育狀況的影響。 3.βB2-晶體蛋白的功能分析 剝離出生后8周的βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠和野生型小鼠眼晶狀體,采用TC-199培養(yǎng)液做離體晶狀體培養(yǎng),放入CO2培養(yǎng)箱

8、2小時(shí)后,用H2O2誘導(dǎo)離體晶狀體氧化損傷,通過晶狀體混濁程度分析其抗氧化損傷能力。剝離βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠眼晶狀體,勻漿離心后取上清液,50℃連續(xù)加熱使蛋白變性,每5分鐘測(cè)定吸光度值,分析其熱穩(wěn)定性；將上述上清液中加入一定比例的H2O2,誘導(dǎo)氧化損傷,每15分鐘測(cè)定吸光度值,可以反映晶體蛋白對(duì)氧化損傷的耐受性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.βB2-晶體蛋白基因敲除小鼠模型建立后,PCR技術(shù)成功檢測(cè)出三種基因型：純合、雜合及

9、野生型小鼠。經(jīng)Western blot鑒定,純合小鼠晶體蛋白未檢測(cè)到βB2-晶體蛋白的表達(dá),雜合及野生型小鼠晶體蛋白在分子量23KD處檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。 2.βB2-晶體蛋白基因敲除后導(dǎo)致了小鼠白內(nèi)障的發(fā)生,最早發(fā)生于出生后8周左右。由βB2-晶體蛋白基因敲除所致的白內(nèi)障均發(fā)生在前或后皮質(zhì)部,隨年齡增加,皮質(zhì)混濁程度逐漸加重。電子顯微鏡顯示純合小鼠晶狀體纖維扭曲紊亂。純合小鼠晶狀體濕重及最大直徑均小于同齡野生型小鼠。