熱休克轉(zhuǎn)錄因子4基因突變致先天性白內(nèi)障分子機(jī)理研究.pdf

1、背景:
　　 熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(heat shock transcription factor4，Hsf4)被認(rèn)為是一種新的與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)基因，在Hsf4 DNA結(jié)合域或其它調(diào)節(jié)域的錯(cuò)義突變與人先天性或家族常染色體顯性或隱性遺傳性白內(nèi)障密切相關(guān)，這些基因突變與動(dòng)物先天性白內(nèi)障發(fā)生也密切相關(guān)，小鼠模型中Hsf4基因缺失可妨礙晶狀體上皮細(xì)胞增殖和纖維細(xì)胞終未分化，從而導(dǎo)致出生后晶狀體核白內(nèi)障。
　　 Hsf4有Hsf4a、

2、Hsf4b兩種亞型，Hsf4b是調(diào)節(jié)鼠晶狀體發(fā)育中唯一亞型，已報(bào)道Hsf4b基因缺失不僅可以下調(diào)許多熱休克蛋白(例如：Hsp25γ-晶體蛋白，β-晶體蛋白和骨骼肌蛋白)的表達(dá)，而且可以上調(diào)鼠晶狀體組織中許多基因的表達(dá)(例如：FGF家族成員)，這些研究表明Hsf4b通過對(duì)其下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制雙重作用而調(diào)控晶狀體發(fā)育，但是，調(diào)節(jié)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的信號(hào)通路還不清楚。
　　 目的:
　　 探討Hsf4調(diào)控晶狀體發(fā)育的

3、分子機(jī)制。通過探究Hsf4在上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，揭示Hsf4基因突變所致先天性白內(nèi)障的致病機(jī)理，為早期診斷和治療Hsf4突變相關(guān)的先天性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 用人心臟cDNA文庫(kù)為模板，應(yīng)用囊括Hsf4b全長(zhǎng)的引物進(jìn)行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag標(biāo)簽。將PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ酶切后，與該二酶線性化pcDNA3.0質(zhì)粒一起連接獲得重組質(zhì)粒pcDNA-Flag-Hsf4

4、b，將克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并用抗Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)Pull down實(shí)驗(yàn)證明Hsf4b可與MAP激酶P38結(jié)合，激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P38可體外磷酸化Hsf4b。
　　 用Hsf4-/-小鼠的晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染SV40,T-抗原，G418篩選建立永生化細(xì)胞系MLEC/Hsf4-/-。應(yīng)用不同的含有CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒(如腺病毒載體)，在mLEC細(xì)胞和其他細(xì)胞系中

5、表達(dá)Hsf4b,測(cè)定Hsf4b對(duì)CMV啟動(dòng)子的抑制作用。DNA-蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)和DNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)體外測(cè)定Hsf4b與CMV啟動(dòng)子的結(jié)合。免疫印跡檢測(cè)Hsf4b/S299磷酸化抑制Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性，免疫沉淀和細(xì)胞內(nèi)GSTpull down實(shí)驗(yàn)證明Hsf4蛋白可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)因子Daxx，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hsf4b被摹集到核內(nèi)Daxx的POD核小體內(nèi)。
　　 結(jié)果:
　　 成功構(gòu)建熱休克轉(zhuǎn)錄因子4b(Hsf4b

6、)的真核表達(dá)載體并在真核細(xì)胞HEK293T中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)Hsf4b可與MAP激酶P38結(jié)合，Hsf4b的C-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)參與和P38的結(jié)合，P38可體外磷酸化Hsf4b。
　　 Hsf4b具有轉(zhuǎn)錄抑制功能，Hsf4b可與CMV啟動(dòng)子中176bp處TTC(HSE序列)的序列直接結(jié)合，抑制CMV啟動(dòng)子活性，把此序列中TTC突變?yōu)镚CC可抑制Hsf4b對(duì)CMV活性的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Hsf4b轉(zhuǎn)錄抑制功能通過與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)因子Daxx結(jié)