先天性白內障和汗孔角化癥基因突變鑒定.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　一、先天性白內障基因突變鑒定
　　目的：
　　白內障是第一位致盲性疾病，全球約5000萬盲人中，白內障患者高達46％。先天性白內障(congenital cataract，CC)是指出生后第一年發(fā)生的晶狀體部分或全部混濁，發(fā)病率為0.01％-0.06％，占全世界兒童致盲性眼病總數的1/10。CC是造成兒童失明和弱視的重要原因，病因有遺傳、宮內感染、藥物和外傷等，其中遺傳性白內障占C

2、C的比例可高達1/4。
　　CC具有高度臨床異質性和遺傳異質性，通常表現為晶狀體的部分或全部混濁，也可作為某些綜合征的表型之一，與小眼球、小角膜、虹膜缺失等先天眼部異常合并存在，還可繼發(fā)于全身代謝性疾病。本實驗室收集了2個CC家系，前期利用眼科遺傳病panel深度測序排除了371個基因，本文利用全外顯子組測序技術結合Sanger測序及連鎖分析等，確定了CC家系的致病基因。
　　實驗材料與方法：
　　一、實驗材料

3、　　中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院收集2例CC家系，均來自于遼寧省，家系成員無近親結婚史，妊娠史正常。經患者和家屬知情同意后，采集家系成員血樣。
　　二、方法
　　1、全外顯子組測序
　　兩個家系各選取兩名患者，提取外周血gDNA，外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序。
　　2、Sanger測序驗證可疑變異
　　Sanger測序驗證全外顯子組測序的結果。
　　3、PCR-RFLP分析
　　針對S

4、anger測序驗證的變異位點設計錯配引物，引入限制性酶切位點，在家系成員和正常無關對照個體中進行限制性片段長度多態(tài)性分析。
　　4、單體型分析和連鎖分析
　　在候選基因及其兩側選取微衛(wèi)星標記，通過8％變性聚丙烯胺凝膠電泳對家系成員進行基因型分析，再根據家系中的血緣關系，按照孟德爾遺傳定律推導出由不同微衛(wèi)星標記構成的單體型。采用Linkage5.2軟件包對家系進行兩點間連鎖分析。連鎖分析結果判斷標準:若LOD值≥3時，該重組率

5、下兩個位點肯定連鎖;若LOD值＞1時，支持連鎖;若LOD值≤-2時，兩個位點的連鎖被排除。
　　5、生物信息學分析
　　利用DNAMAN5.2軟件分析突變位點的保守性;利用ProtScale、ProtParamtool及Jmol軟件預測突變對蛋白結構和功能的影響;利用在線軟件Polyphen2、PROVEAN和SIFT預測突變的致病性。
　　6、MSH3表達分析
　　利用RT-PCR檢測人晶狀體上皮細胞SRA01

6、/04及老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中MSH3的表達;利用免疫熒光分析MSH3蛋白在24周人胎眼晶狀體中的表達。
　　結果：
　　1、全外顯子組測序篩查可疑變異
　　利用全外顯子組測序技術，家系1我們篩查到119個可疑變異，家系2篩查到82個可疑變異。
　　2、候選致病基因位點PCR擴增及Sanger測序
　　經Sanger測序證實家系1MSH3基因第23外顯子雜合錯義突變c.3181A＞G(p.R106

7、1G)，家系2CRYGS基因第2外顯子雜合錯義突變c.199T＞A(p.Y67N)。
　　3、PCR-RFLP分析
　　分別對家系成員和無關正常對照個體進行PCR-RFLP分析，家系患者均攜帶突變（家系1Ⅳ:5除外），而家系中表型正常的個體和無關正常對照個體均未檢測到MSH3 c.3181A＞G(p.R1061 G)和CRYGSc.199T＞A(p.Y67N)變異。
　　4、單體型分析和連鎖分析
　　家系1中所有

8、患者共享3-6-3-7-4-3-1-4-5單體型，家系2患者共享的單體型為2-7-5-2-6-1。家系1的5q14.1位點兩點連鎖分析，當θ=0時MSH3-STR18得到最大LOD值2.05，支持家系1與5q14.1位點連鎖;家系2的3q27.3位點兩點連鎖分析，當θ=0時CRYGS-STR8得到最大LOD值3.82，提示肯定連鎖。
　　5、生物信息學分析
　　MSH3蛋白R1061位點和CRYGS蛋白Y67位點均高度保守，

9、突變改變了蛋白的疏水性和空間結構，影響蛋白質功能，可能為有害突變。
　　6、MSH3表達分析
　　RT-PCR結果顯示MSH3在晶狀體上皮細胞SRA01/04中高表達，在老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中表達降低;免疫熒光實驗結果表明MSH3在24周人胎眼晶狀體上皮細胞高表達;利用眼基因發(fā)現集成系統(tǒng)工具iSyTE檢索MSH3在胎鼠晶狀體中高表達。
　　7、CRYGS蛋白在SRA01/04細胞定位分析
　　免疫熒光結

10、果表明野生型和突變型CRYGS蛋白在細胞質和細胞膜中均有表達，且在細胞膜上高表達，但二者的亞細胞定位無明顯差異。
　　結論：
　　(1)CC家系1致病基因突變可能是MSH3雜合錯義突變c.3181A＞G(p.R1061 G)。MSH3在人胎眼晶狀體組織和人晶狀體上皮細胞高表達，MSH3可能與晶狀體發(fā)育相關。
　　(2)CC家系2致病基因突變?yōu)镃RYGS基因雜合錯義突變c.199T＞A(p.Y67N)，野生型和突變型CR

11、YGS蛋白亞細胞定位無明顯差異。
　　二、汗孔角化癥基因突變鑒定
　　目的：
　　汗孔角化癥(Porokeratosis，PK)是一種常染色體顯性遺傳的角化異常性皮膚病，其臨床特征為中央萎縮，邊緣呈嵴狀隆起的淺褐色環(huán)狀皮損。本病特征性病理改變是皮膚中央溝內的角化不全柱（角樣板），有時可見柱基底部有角化不全細胞，真皮層可見淋巴細胞浸潤，以及顆粒層變薄或缺失等特征。
　　PK具有家族聚集性和外顯不全的特性，至今發(fā)病機

12、制尚未完全闡明。DSAP有明顯的遺傳異質性，2012年張學軍教授首次證實甲羥戊酸激酶基因MVK(12q23.2-24.1)是DSAP的致病基因，2015年張正華報道甲羥戊酸通路PMVK(1q21.3)、MVD(16q24.1-24.3)、FDPS(1q22)等基因突變也可以導致PK的發(fā)生。甲羥戊酸通路參與類異戊二烯和膽固醇的生物合成，膽固醇的生物合成異?？赡苁且餚K發(fā)生的原因之一。此外，SLC17A9(20q13.33)基因突變也可導

13、致DSAP發(fā)病。
　　本文以7個中國PK家系和2個散發(fā)病例為研究對象，通過Sanger測序對MV、MVD、PMVK、FDPS和SLC17A9基因的全部外顯子及其側翼區(qū)域進行突變檢測，為PK分子機制的研究提供理論依據。
　　實驗材料與方法：
　　一、實驗材料
　　本室收集了7個中國PK家系和2個散發(fā)PK病例，其中家系1、2、3和4來自江蘇，家系5和6來自山東，家系7來自廣州，散發(fā)患者分別來自黑龍江和甘肅。經患者及家

14、屬知情同意后，我們收集了患者的臨床資料和血樣，并對病變部位進行了拍照。
　　二、方法
　　1、PK致病基因突變篩查
　　提取家系成員的外周血基因組DNA，以先證者DNA為模板，PCR擴增MVD、MVK、PMV、FDPS、SLC17A9基因全部外顯子及其側翼序列，PCR產物直接送公司進行Sanger測序。針對可疑變異位點，對家系中其他成員進行雙向測序驗證。
　　2、PCR-RFLP驗證分析
　　針對MVD基因

15、c.916G＞A和PMVK基因c.65A＞G突變分別設計錯配引物，引入PmaCⅠ和StuⅠ限制性內切酶識別位點，分別在家系成員和120名正常無關對照個體中進行限制性片段長度多態(tài)性分析。
　　3、生物信息學分析
　　利用DNAMAN5.2軟件分析基因突變位點的保守性;利用ProtScale和Jmol軟件預測突變對蛋白的結構和功能的影響;利用在線軟件Polyphen2和SIFT預測突變的致病性。
　　結果：
　　1、

16、候選致病基因Sanger測序結果
　　以7個PK家系的先證者及2個散發(fā)患者的DNA為模板，對候選致病基因MVD、MVK、PMVK、FDPS、SLC17A9進行Sanger測序，家系1、2和3均為MVD基因雜合錯義突變c.746T＞C(p.F249S)。家系5為MVD基因雜合錯義突變c.916G＞A(p.A306T)，家系6為PMVK基因雜合錯義突變c.65A＞G(p.K22R)，而家系4、家系7及2個散發(fā)患者未發(fā)現可疑變異。

17、>　　2、PCR-RFLP分析結果
　　家系正常個體和120名無關正常對照個體中均未檢測到MVD基因c.916G＞A和PMV基因c.65A＞G變異。
　　3、生物信息學分析
　　通過生物信息學軟件預測MVD p.A306和PMVK p.K22位點均高度保守，p.A306T和p.K22R突變分別改變了MVD和PMVK蛋白的疏水性和空間結構，可能影響蛋白質功能，利用SIFT等軟件預測為有害突變。
　　結論：
　

18、　本文通過對PK致病基因MVK、MVD、PMVK、FDPS和SLC17A9進行PCR擴增及Sanger測序，家系1、2和3檢測到MVD基因雜合錯義突變c.746T＞C(p.F249S);家系5檢測到MVD基因雜合錯義突變c.916G＞A(p.A306T);家系6檢測到PMVK基因雜合錯義突變c.65A＞G(p.K22R)，其中MVD基因c.916G＞A(p.A306T)和PMVK基因c.65A＞G(p.K22R)為國際上尚未報道的突變，