轉(zhuǎn)移癌和其原發(fā)癌的比較研究及其在腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)和治療的意義.pdf

1、轉(zhuǎn)移癌和其原發(fā)癌的比較研究及其在腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)和治療的意義
　　 一.研究背景和研究目的
　　 轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的根本因?yàn)?目前尚無(wú)有效的措施可以阻止轉(zhuǎn)移。闡明癌癥轉(zhuǎn)移的機(jī)制是干預(yù)或控制腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),目前對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移認(rèn)識(shí)有不同的學(xué)說(shuō),但是這些學(xué)說(shuō)尚不能解釋全部腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。現(xiàn)代生物技術(shù)和納米制藥技術(shù)的進(jìn)步為發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)藥物商品化提供了可能,但是現(xiàn)有對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)是建立在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,很

2、少有開(kāi)展原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的配對(duì)比較研究的。研究同一病人原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌為加深認(rèn)識(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)提供了可能。已有文獻(xiàn)開(kāi)展的對(duì)原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的研究則主要集中在乳腺癌和結(jié)腸癌,而對(duì)肺癌報(bào)道的文獻(xiàn)僅占少部分,并且主要集中在EGFR和其調(diào)節(jié)通路上。
　　 肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,就診時(shí)70％左右的患者已處于中晚期,即使手術(shù)切除后患者2年內(nèi)也多死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,研究肺癌轉(zhuǎn)移有望解決肺癌目前治療困境。乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)

3、制研究比較深入,現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的基因有可能成為新的抗轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn),由于這些關(guān)鍵基因和分子在癌癥中普遍發(fā)揮重要作用,這為研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。分子靶向治療是目前癌癥治療的組成部分,但是分子靶向治療的療效與其分子表達(dá)狀態(tài)有關(guān),比較肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶分子狀態(tài)的異同性可以為臨床醫(yī)生在選擇分子靶向治療時(shí)提供參考意見(jiàn)。肺癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺多原發(fā)癌一直是困擾臨床醫(yī)生的主要難題,由于多原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移預(yù)后不同,比較原發(fā)和轉(zhuǎn)移首先是確定的肺癌

4、轉(zhuǎn)移灶,因此區(qū)分肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移是進(jìn)行肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶比較研究的基礎(chǔ)。一些關(guān)鍵分子蛋白的表達(dá)與肺癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān),癌基因EGFR已經(jīng)作為分子靶點(diǎn)用于治療肺癌,血管生成因子VEGF抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn),MET、HIF-1α、TGF-β1是癌癥潛在的治療靶點(diǎn)。但是對(duì)于這些基因的研究在肺癌主要集中在原發(fā)腫瘤的研究,在肺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮怎樣的作用還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)告。p53作為肺癌的關(guān)鍵抑癌基因,其突變和多態(tài)性和肺癌易感性密切相關(guān),有研究者通過(guò)p

5、53基因突變鑒別肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移,其理論基礎(chǔ)是建立在p53基因突變發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移之前,轉(zhuǎn)移和原發(fā)灶有共同的克隆來(lái)源和分子基礎(chǔ),一致的為肺內(nèi)轉(zhuǎn)移,不一致的為肺內(nèi)原發(fā),但是其他研究者在乳腺癌和結(jié)腸癌研究p53基因突變?cè)谠l(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶存在一定的差異。這就使得需要尋找更好的鑒別肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移的工具。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是第三代基因多態(tài)性,是更好地反映個(gè)體遺傳差異的分子標(biāo)記,在腫瘤研究中有廣泛用途,p53的72密碼子SNP與肺癌個(gè)體易感性已有相

6、關(guān)研究,本課題意在比較原發(fā)肺癌和其轉(zhuǎn)移癌的p53的72密碼子SNP狀態(tài)并且探討作為鑒別肺內(nèi)原發(fā)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的可能性。
　　 因此,本課題研究目的是:
　　 1.比較肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、血管生成因子VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-α、在器官選擇性轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用的TGF-β1、參與腫瘤微環(huán)境的腫瘤壞死因子TNF-α、抑癌基因p53、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子MET和參與腫瘤特異性轉(zhuǎn)移的COX2的蛋白的表達(dá),為認(rèn)識(shí)

7、肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制、豐富和發(fā)展腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)說(shuō)、預(yù)測(cè)肺癌轉(zhuǎn)移、發(fā)現(xiàn)可能的抗肺癌轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)奠定研究基礎(chǔ)。
　　 2.通過(guò)p53的72密碼子SNP鑒別肺內(nèi)原發(fā)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移,研究p53的72密碼子的多態(tài)性作為鑒別肺癌肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移的工具的可能性。
　　 二.臨床資料和方法
　　 在病理庫(kù)中收集2002年-2009年期間在山東省立醫(yī)院住院的原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移肺癌均切除的石蠟標(biāo)本,共有11例為確認(rèn)的肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移,3例其轉(zhuǎn)移灶從現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不

8、能確認(rèn)是肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中1例肺癌原發(fā)灶有2個(gè)石蠟標(biāo)本。共收集29個(gè)石蠟標(biāo)本進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn):
　　 1.常規(guī)HE染色:確認(rèn)肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移來(lái)自同一標(biāo)本
　　 2.SP方法免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
　　 3.提取石蠟標(biāo)本中的DNA采用凱杰生物技術(shù)有限公司石蠟標(biāo)本提取試劑盒,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。
　　 4.設(shè)計(jì)p53的72密碼子的多態(tài)性引物,提取的DNA樣本進(jìn)行聚合酶連反應(yīng)擴(kuò)增,

9、反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行限制酶內(nèi)切反應(yīng),圖像儀下觀察p53的72密碼子基因型。
　　 5.蛋白表達(dá)強(qiáng)度在原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的比較采用Marginal Homogeneity統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
　　 三.結(jié)果
　　 1.臨床資料
　　 2.免疫組化結(jié)果
　　 3.DNA提取結(jié)果3個(gè)病例未能從對(duì)應(yīng)的石蠟標(biāo)本中提取出有效的DNA。11例23標(biāo)本中DNA質(zhì)量在10ug-15ug之間,純度經(jīng)測(cè)定符合PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)
　　 4

10、.p53codon72 SNPg9例確認(rèn)為轉(zhuǎn)移的8例一致,不一致的1例原發(fā)腫瘤為基因型純合子,腦轉(zhuǎn)移腫瘤為雜合子。另外3例不能確認(rèn)是否轉(zhuǎn)移的,原發(fā)腫瘤一致的基因型一致,通過(guò)對(duì)照同一病例不同標(biāo)本和原發(fā)轉(zhuǎn)移SNP的狀態(tài)確定這3例為轉(zhuǎn)移瘤。
　　 5.14例原發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能蛋白表達(dá)COX2不一致的2例,P值=0.157；MET不一致3例,P值=0.564:VEGF不一致的3例,P值=0.083；HIF-1α不一致的2例,P值=0.18

11、0、TNFα不一致的1例,P值=0.317；p53表達(dá)不一致4例,P值=0.317,差異均未達(dá)到顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均大于0.05。
　　 四.結(jié)論
　　 1.肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶在病理分級(jí)方面存在一些差異,這種差異主要見(jiàn)于原發(fā)癌具有多種分化程度的,而轉(zhuǎn)移癌只有一種分化程度,沒(méi)有觀察到腫瘤演進(jìn)過(guò)程中轉(zhuǎn)移分化程度降低,提示轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌有共同的克隆來(lái)源。肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移在功能蛋白表達(dá)具有一定的差異性,但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,原發(fā)癌和

12、轉(zhuǎn)移癌具有較高的一致性,提示轉(zhuǎn)移癌保持了原發(fā)癌的關(guān)鍵生物學(xué)特征。
　　 2.CD133是否可以作為肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記還需要進(jìn)一步研究,VEGF、COX2原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶表達(dá)具有高度的相似性,在應(yīng)用貝伐單抗和賽來(lái)昔布治療肺癌時(shí)如果不能獲得轉(zhuǎn)移癌組織可以通過(guò)原發(fā)癌的表達(dá)預(yù)測(cè)其抑制劑的療效。MET、HIF-1α是肺癌抗轉(zhuǎn)移潛在的有效靶點(diǎn),TGF-β1和TNFα在腫瘤間質(zhì)和腫瘤細(xì)胞均有表達(dá),是否可以作為抗轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。
　

13、　 3.p53的密碼子72的SNP是區(qū)分原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的有效工具,原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移以及其他部位的轉(zhuǎn)移灶存在高度一致性,反映原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移癌在遺傳背景上高度一致,但仍然有1例不一致,提示p53在轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)生了突變。
　　 4.轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌在細(xì)胞形態(tài)和分級(jí)、功能蛋白表達(dá)和p53的72密碼子多態(tài)性的高度相似性,提示轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌有共同的克隆來(lái)源,轉(zhuǎn)移癌保持了原發(fā)癌的關(guān)鍵生物學(xué)特征。而功能蛋白表達(dá)及p53 condon7