14-3-3γ調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和泌乳.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷改善，奶產(chǎn)品在整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中所占的地位日益提高。為了提高產(chǎn)奶量，往往在奶牛飼糧中添加大量高精飼料，這樣做雖然在一定程度上提高了奶牛的產(chǎn)奶性能，但卻非常容易引發(fā)瘤胃亞急性酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)。作為一種常見的代謝疾病，SARA的發(fā)病率較高，在奶牛泌乳早期和中期高達(dá)20％以上，并且有逐年上升的趨勢(shì)，這給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)SARA發(fā)生時(shí)，瘤胃內(nèi)的細(xì)菌脂多糖(li

2、popolysaccharid，LPS)濃度增加，刺激機(jī)體釋放大量的炎癥細(xì)胞因子，致使機(jī)體產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)和代謝模式的變化，從而導(dǎo)致奶牛的產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)下降。因此，如何抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高產(chǎn)奶量成為我們迫切需要解決的重要奶業(yè)科學(xué)問題。
　　14-3-3蛋白家族是高度保守的二聚體蛋白，廣泛地存在于幾乎所有生物體細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物中有7種亞型（β、γ、ε、ζ、η、σ和τ），在抑制細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控

3、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，14-3-3γ參與了許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并在一些病理過程中表達(dá)量升高。這些研究結(jié)果提示我們，14-3-3γ可能在提高機(jī)體對(duì)損傷的反應(yīng)性以及抗損傷修復(fù)等方面非常重要。本項(xiàng)目前期研究結(jié)果顯示，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中14-3-3γ過表達(dá)能夠有效促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪的合成，并能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性。那么，14-3-3γ是否能通過抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和促進(jìn)泌乳功能進(jìn)而提高SARA奶牛的產(chǎn)奶量

4、和奶品質(zhì)就成為了我們研究的重點(diǎn)。
　　本研究中，利用組織塊培養(yǎng)法成功地獲得了原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并建立了體外細(xì)胞泌乳模型;通過檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的毒性作用，篩選出了最佳的LPS濃度用以復(fù)制細(xì)胞炎癥模型;用CASY-TT方法、LDH活性測(cè)定法、吖啶橙熒光染色法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性、增殖能力和凋亡情況;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使得14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行超表達(dá)或基因沉默;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量

5、RT-PCR法及蛋白免疫印跡（Western blotting）技術(shù)檢測(cè)了泌乳相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)變化;用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)了β-酪蛋白的表達(dá)變化和炎癥通路中相關(guān)基因的蛋白表達(dá)變化;用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和ELISA法測(cè)定了炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和分泌情況;用甘油三酯試劑盒和乳糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯和乳糖的含量變化;用酶活性試劑盒檢測(cè)了脂肪酸合成酶活性變化。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:<

6、br>　　1.LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有一定的毒性作用CASY分析法、LDH活性測(cè)試法、吖啶橙熒光染色法及流式細(xì)胞技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，LPS可以降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性和增殖能力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這種毒性作用具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　2.LPS影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳功能和泌乳相關(guān)基因的表達(dá)。
　?、贆z測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌甘油三酯、乳糖及β-酪蛋白的結(jié)果表明，LPS能顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞的

7、泌乳功能。當(dāng)LPS濃度大于等于100ng/mL時(shí)，甘油三酯含量與對(duì)照組相比較顯著降低(P＜0.05);當(dāng)LPS的濃度大于等于1000ng/mL時(shí)，乳糖含量與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05);當(dāng)LPS濃度大于100ng/mL時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)β-酪蛋白的表達(dá)降低。
　?、跓晒舛縍T-PCR檢測(cè)表明，LPS下調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳有關(guān)基因的mRNA表達(dá)。與對(duì)照組相比，1000ng/mLLPS能顯著降低mTOR、STAT5、S6

8、K1、AKT1、4EBP1、PPARγ、SREBP1、FABP3、ACC、FAS和GLUT1的mRNA表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01）。
　?、踂estern blotting檢測(cè)表明，LPS下調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳有關(guān)基因的蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比，1000ng/mL LPS能顯著抑制mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、AKT1、p-AKT1、SREBP1、PPARγ和GLUT1的蛋白表達(dá)(P＜0.05)。

9、　　3.LPS引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞14-3-3γ表達(dá)升高，提示14-3-3γ可能參與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程。
　　4.14-3-3γ超表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌炎性因子和下調(diào)炎癥相關(guān)信號(hào)通路。
　?、贌晒舛縍T-PCR和ELISA檢測(cè)表明，14-3-3γ超表達(dá)可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的mRNA表達(dá)，并且顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α

10、和IL-6的含量，與LPS組相比差異顯著(P＜0.05)。
　?、赪estern blotting檢測(cè)表明，14-3-3γ超表達(dá)抑制TLR4蛋白的表達(dá)，下調(diào)NF-κB和MAPK信號(hào)通路。14-3-3γ超表達(dá)抑制IκB-α、ERK1/2和p38的磷酸化以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位，與LPS組相比差異顯著(P＜0.05)。
　　5.14-3-3γ對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性及其泌乳的影響。
　　①CASY分析法、流式細(xì)胞技

11、術(shù)等檢測(cè)結(jié)果表明，與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ超表達(dá)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性和增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡;與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性和增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示14-3-3γ對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用。
　?、跈z測(cè)細(xì)胞分泌甘油三酯、乳糖和β-酪蛋白結(jié)果表明，與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ超表達(dá)能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂、乳糖和

12、乳蛋白的合成和分泌;與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌。
　　③熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)表明，與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ超表達(dá)增加mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的mRNA和蛋白表達(dá)量;與LPS對(duì)照組相比，14-3-3γ基因沉默減少mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和

13、GLUT1的mRNA和蛋白表達(dá)量。
　　綜上，14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的抗損傷保護(hù)作用。14-3-3γ可以通過降低NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活性而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的分泌，減輕奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并且14-3-3γ能增加泌乳相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性、增殖能力和乳成分的合成、分泌。本研究為有效控制LPS引起的奶牛泌乳能力下降和提高乳品質(zhì)