鴨α干擾素原（真）核表達及其生物學活性研究.pdf

1、本文對四川省內(nèi)地方品種四川麻鴨的干擾素進行如下系列研究：對四川麻鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進行克隆、鑒定和序列分析；構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達載體和真核表達載體；IFN-α原核表達及其生物學活性研究；利用雛鴨為模型，應(yīng)用免疫組織化學方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表達質(zhì)粒在鴨體內(nèi)的動態(tài)表達分布規(guī)律；同時對作為免疫佐劑的pcDNA-SDIFN-α真核表達質(zhì)粒免疫調(diào)節(jié)活性進行研究，獲得以下結(jié)果： 1.四川麻鴨IFN

2、-αORF基因克隆、序列比對分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計了兩對加入EcoRI和BamHI兩個酶切位點的特異性引物對，采用PCR和nest-PCR的方法，從鴨肝臟組織基因組DNA擴增得到大小兩個完全包含麻鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。其中小片段更適合用于表達，并將其進行pGEM-T載體克隆與測序，對測序結(jié)果采用ClustalX軟件進行序列分析以及與北京鴨、雞、鵝等NCBI上序列進行了比較。結(jié)果顯示四川麻鴨與

3、北京鴨ORF基因序列十分相似，其核苷酸同源性達到99.13％，氨基酸同源性為98.96％。與雞的核苷酸及氨基酸同源性分別為71.8％、49.97-50.47％，與鵝的核苷酸同源性為96％。同時用BioEdit、NetNGlyc、TreeView軟件對該基因所推測的蛋白進行了分析，結(jié)果表明四川麻鴨有2個潛在糖基化位點，1個蛋白激酶C磷酸化位點(ProteinkinaseCphosphorylation)和1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(Cas

4、einkinaseⅡphosphorylationsite)，信號肽切割位點28-29位ANA和FS氨基酸之間，成熟的鴨α干擾素有5個疏水區(qū)，無跨膜區(qū)。 2.SDIFN-αORF基因原核表達載體pBV220-SDIFN-α的構(gòu)建及表達產(chǎn)物的抗病毒活性 采用BamHI和EcoRI酶切，通過定向粘末段連接法，構(gòu)建了原核表達載體pBV220-SDIFN-α質(zhì)粒。并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達菌株DH5α中進行表達，采用溫度誘導的方式，

5、對誘導后的菌液進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示工程菌進行了表達，產(chǎn)生的包涵體蛋白分子量為40KD左右。對純化后的包涵體采用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性，采用VSV/DEF系統(tǒng)初步檢測抗病毒活性，干擾素的抗病毒活性約為150U/ml，比活力為440U/mg。應(yīng)用FQ-PCR檢測方法，動態(tài)監(jiān)測體內(nèi)抑制DHBV和體外抑制DPV病毒核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達的干擾素具有強烈的病毒復(fù)制抑制作用，具有明顯的生物學活性。 3.SDIFN-αORF基因真核表

6、達載體pcDNA-SDIFN-α的構(gòu)建及鑒定 利用合成在引物兩端的EcoRI、BamHI酶切位點，將目的基因成功地從pGEM-T載體克隆重組體中切下，并通過粘端連接的方法，連接到pUC18定向位置上，然后用EcoRI和XbaI雙酶切真核表達載體pcDNA3.1(+)和pUC18-SDIFN-α，實現(xiàn)了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1(+)載體上。四川麻鴨IFN-α真核表達重組質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α經(jīng)BamHI、E

7、coRI和XbaI三種酶切驗證，并測序證明四川麻鴨IFN-α的真核表達質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α構(gòu)建正確。 4.免疫組織化學檢測真核表達質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)表達方法的建立及動態(tài)表達規(guī)律的研究 以pcDNA-SDIFN-α真核質(zhì)粒免疫鴨，分時間段采集鴨16種不同組織，建立了免疫組織化學檢測方法，并應(yīng)用該方法檢測干擾素在體內(nèi)的動態(tài)表達規(guī)律。pcDNA-SDIFN-α免疫鴨后，持續(xù)表達時間長達9周。能在肺

8、臟細胞、心肌細胞、肝細胞、脾細胞、腸腺和腸絨毛細胞、肌肉細胞、皮膚內(nèi)檢測到表達產(chǎn)物，在14d-35d進行了高峰表達。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未檢測到陽性黃色顆粒，肺臟、免疫部位最早出現(xiàn)陽性顆粒，腦組織細胞中陽性顆粒數(shù)量隨時間變化較小。其中基因槍免疫鴨后，各組織中的含量和表達量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為6μg組＞3μg組＞1μg組。肌肉注射免疫鴨后，各組織中的含量和表達量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為200μg組＞100μg組＞50μg組，都具有一定的劑量相

9、關(guān)性。基因槍轟擊法較肌肉注射法IFN-α基因表達出現(xiàn)的時間早，3h就可以檢測到表達產(chǎn)物。同時，相對于肌肉注射法免疫，基因槍轟擊法所用的表達質(zhì)粒用量更少。 5.真核表達質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑活性的初步研究 以pcDNA-SDIFN-α真核表達質(zhì)粒為免疫調(diào)節(jié)劑，研究對DPV/DVH弱毒苗免疫活性調(diào)節(jié)作用。分不同時間段采血，采用MTT法測定鴨外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化效果、CD3+T淋巴細胞數(shù)量變化和特異性