無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷技術(shù)的改進(jìn)與應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷對(duì)孕婦的損害是不言而喻的。雖然診斷的準(zhǔn)確率較高，但有損傷胎兒或?qū)е略袐D流產(chǎn)、感染的可能。1969年，Walknowska等在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒核型的細(xì)胞(46，XY)。這使得人們可以通過獲取孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞，進(jìn)行無創(chuàng)性的產(chǎn)前基因診斷。這種方法對(duì)孕婦和胎兒無損傷，具有取材方便、風(fēng)險(xiǎn)小，不受孕婦年齡和病史等影響的優(yōu)點(diǎn)，是目前產(chǎn)前診斷發(fā)展的方向。有多種富集和分離胎兒有核紅細(xì)胞的方法可供選擇：如利用有核紅細(xì)胞物理特

2、性的密度梯度離心法，或利用有核紅細(xì)胞表面相對(duì)特異性抗原的MACS、FACS法，還有利用有核紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白γ鏈、ε鏈、ξ鏈的單克隆抗體免疫標(biāo)記法。本課題組前期利用胎兒有核紅細(xì)胞抗血紅蛋白γ鏈抗體標(biāo)記，獲得特異的胎兒細(xì)胞，成功地進(jìn)行了遺傳病的產(chǎn)前基因診斷。血紅蛋白ε鏈、ξ鏈?zhǔn)浅霈F(xiàn)在孕早期的胚胎血紅蛋白鏈，具有更高的特異性。我們嘗試應(yīng)用抗血紅蛋白ε鏈抗體標(biāo)記胎兒細(xì)胞，在孕早期進(jìn)行診斷，以期獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。選擇抗體標(biāo)記的方法特異性較高，但

3、成本也較高，同時(shí)操作較繁瑣。所以我們建立了利用胎兒和成人血紅蛋白間生化差異的Kleihauer抗酸染色法。這是一種簡(jiǎn)單、快速、有效的胎兒細(xì)胞標(biāo)記方法，適合于臨床推廣應(yīng)用。 標(biāo)記后的胎兒細(xì)胞通過顯微操作方法挑取出來后，必須進(jìn)行全基因組擴(kuò)增獲得完整的胎兒基因組序列，以滿足后續(xù)基因診斷的需要。現(xiàn)行的PEP法和DOP-PCR法都是基于PCR的全基因組擴(kuò)增方法，不可避免會(huì)產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，不完全的位點(diǎn)覆蓋率甚至位點(diǎn)或等位片段的缺失，

4、這些都會(huì)對(duì)基因診斷的結(jié)果造成嚴(yán)重的影響。最近一種新的全基因擴(kuò)增技術(shù)：多重置換擴(kuò)增(MultipleDisplacementAmplification，MDA)，能夠提供高度均一完整的全基因組序列，確保最低的位點(diǎn)擴(kuò)增誤差，是一種真正意義的全基因組擴(kuò)增方法。我們用此方法進(jìn)行胎兒有核紅細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增，以探討其在無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷中應(yīng)用的可行性。 實(shí)驗(yàn)材料與方法20例受試者，其中12例為孕有杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)高風(fēng)險(xiǎn)患兒的孕婦，

5、5例為孕有苯丙酮尿癥(PKU)高風(fēng)險(xiǎn)患兒的孕婦(均來自于本遺傳診斷室的咨詢者)，孕7-25周。1例胎兒臍血作為陽性對(duì)照；2例正常未孕女性作為陰性對(duì)照。 本實(shí)驗(yàn)以不連續(xù)密度梯度離心法初步富集孕婦外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞，細(xì)胞涂片離心機(jī)制片，然后用抗血紅蛋白γ鏈、ε鏈抗體和Kleihauer抗酸染色法分別標(biāo)記胎兒有核紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)、定位后在倒置顯微鏡下顯微操作獲取陽性胎兒細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行MDA全基因組擴(kuò)增。然后進(jìn)行性別鑒定及STR連鎖分

6、析檢測(cè)，驗(yàn)證有核紅細(xì)胞的來源，同時(shí)完成遺傳病的無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)抗血紅蛋白ε鏈抗體免疫組化標(biāo)記，檢測(cè)到胎兒有核紅細(xì)胞最早期為孕7周，最適孕周為孕7-15周。經(jīng)Kleihauer染色檢測(cè)到胎兒有核紅細(xì)胞的最早期為孕8周，最適孕周為孕10-22周。檢測(cè)數(shù)量從4個(gè)/10ml到19個(gè)/10ml不等，平均為9.5個(gè)/10ml。MDA擴(kuò)增后的DNA與PEP擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，顯示MDA片段長(zhǎng)度＞15kb，而PEP擴(kuò)增

7、片段平均1kb左右。完成12例DMD的產(chǎn)前基因診斷，檢測(cè)出4名男性患兒，4例診斷為正常男性胎兒，1例診斷為女性攜帶者，3例為正常女性胎兒。完成5例PKU的產(chǎn)前基因診斷，檢測(cè)出2例患者，2例正常胎兒，還有1例因STR不提供信息而無法診斷。 結(jié)論1、選擇更特異的抗血紅蛋白ε鏈抗體標(biāo)記胎兒有核紅細(xì)胞，在孕早期即可進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。 2、建立一種簡(jiǎn)單、快速的Kleihauer抗酸染色法標(biāo)記胎兒有核紅細(xì)胞。 3、國(guó)內(nèi)首次建