四種遺傳性骨病的基因診斷與產(chǎn)前診斷.pdf

1、遺傳性骨病是一大類臨床和遺傳異質性較強的骨軟骨發(fā)育不良疾病,常見的臨床表現(xiàn)包括矮身材、畸形、不成比例生長以及單個或一組骨骼發(fā)育不良,主要有軟骨發(fā)育不全(ACH)、脊柱骨骺發(fā)育不良(SED)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不全(MED)等疾病。遺傳性骨病的致病基因主要包括成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)、Ⅰ型膠原(COL1A1)、Ⅱ型膠原(COL2A1)等。本研究對遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(SEDT,MIM271600)、軟骨發(fā)育不全(ACH,MIM

2、100800)、成骨不全(OI,MIM166200)以及先天性脊柱骨骺發(fā)育不良(SEDC,OMIM183900)等遺傳家系進行研究,在明確其臨床診斷的基礎上,檢測致病基因,為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢以及致病機制的研究奠定基礎。
　　 本研究分為三部分:第一部分報告1個涉及5代63人6例遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(spondyloepipbtyseal dysplasia tarda,SEDT)患者的家系,臨床特征主要為短軀

3、干性侏儒和脊柱側彎,X線表現(xiàn)為腰椎體前部上下緣凹陷,中后部呈駝峰狀突起等。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)一個新的基因突變位點,豐富了SEDT的基因型-表型譜,并探討基因突變致選擇性剪接的可能機制。
　　 方法:針對SEDL基因編碼區(qū)設計引物,PCR擴增,并進行序列分析與比對。提取外周血淋巴細胞總RNA,RT-PCR擴增轉錄本,克隆測序并進行序列分析與比對。
　　 結果:基因組DNA測序結果顯示,家系中所有患者SEDL基因exon3均

4、發(fā)生突變(c.61 G>T,p.Glu21stop),所有攜帶者均為雜合突變,家系中其他成員及400例正常對照中均未見該突變,提示SEDL基因c.61 G>T突變是導致該SEDT家系患者發(fā)病的原因。檢索基因突變數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻顯示c.61 G>T突變是SEDL基因新的突變位點。SEDL基因cDNA測序亦發(fā)現(xiàn)c.61 G>T突變,證實了DNA測序結果。有趣的是,RT-PCR結果發(fā)現(xiàn)所有患者和攜帶者均存在兩種轉錄本,較長者為正常大小的轉錄

5、本,較短者缺失了112bp(c.-19-c.93 del)。生物信息學分析顯示,SEDL基因c.61 G>T突變后產(chǎn)生3個剪接抑制子。
　　 結論:SEDL基因c.61 G>T突變是一新突變方式,詳細的臨床與分子遺傳學研究豐富了SEDT的基因型.表型譜。SEDL基因突變結果對攜帶者檢測、癥狀前診斷以及患者和攜帶者的產(chǎn)前基因診斷具有重要意義。SEDL基因c.61 G>T(p.Glu21stop)突變可能激活了潛在可變剪接調控元件,

6、抑制了exon3的剪接,轉錄本跳躍exon3產(chǎn)生轉錄變異體。該基因突變致選擇性剪接的分子機制及生物學效應值得進一步研究。
　　 第二部分報告了3例散發(fā)的軟骨發(fā)育不全(achondroplasia,ACH)病例,臨床主要表現(xiàn)為身材矮小不成比例,短而粗的三叉手,X線特征為腰椎椎弓根間距進行性狹窄,管狀骨短。進行分子遺傳學研究,為ACH的產(chǎn)前分子診斷奠定基礎。
　　 方法:針對FGFR3基因突變位點exon10片段設計引物,P

7、CR擴增,并進行序列分析與比對。
　　 結果:3例患者.FGFR3基因均發(fā)生c.1138 G>A雜合突變,導致氨基酸發(fā)生Gly380Cys改變。其中1例已妊娠11周,等待進行產(chǎn)前分子診斷。
　　 結論:3例患者均由于FGFR3基因發(fā)生c.1138 G>A突變導致ACH,明確了ACH臨床診斷,為產(chǎn)前分子診斷提供了實驗依據(jù)。
　　 第三部分研究膠原基因COL1A1和COL2A1突變所致疾病的基因診斷與產(chǎn)前診斷。報告1

8、例成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)患者,并進行Ⅰ型膠原基因突變篩查,OI臨床表現(xiàn)為骨脆性增加,藍鞏膜,易骨折,X線表現(xiàn)為骨質疏松,長骨皮質菲薄,骺端膨大。另外,對1例Ⅱ型膠原COL2A1基因G504S突變致先天性脊柱骨骺發(fā)育不良(spondylepiphyseal dysplasia congenita,SEDC)患者的妻子進行產(chǎn)前分子診斷,避免患兒出生。SEDC臨床特征為身材矮小,短頸、跛行,手部正常,

9、X線特征為扁平椎體、脊柱側彎、股骨頭骨化缺如等。
　　 方法:針對COL1A1基因編碼區(qū)設計引物,PCR擴增,并進行序列分析與比對。SEDC患者妻子于20孕周在B超引導下進行羊膜囊穿刺,抽取羊水10ml,提取羊水細胞基因組DNA。選擇3個多態(tài)性STR位點,即D3S1358、D16S539和D21S11,排除母體細胞污染。在此基礎上,對COL2A1基因exon23進行擴增,PCR產(chǎn)物進行正、反向測序。
　　 結果:OI患者

10、COL1A1基因exon45發(fā)生c.3263 G>A(p.Gly1088Glu)雜合突變,其父母、妹妹以及250例正常對照均未見該突變,提示COL1A1基因c.3263 G>A是該OI患者的遺傳基礎。檢索基因突變數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻顯示c.3263 G>A突變是COL1A1基因新的突變位點。進行SEDC產(chǎn)前分子診斷的胎兒COL2A1基因exon23正常,未帶有與父親相同的突變,且胎兒產(chǎn)前分子診斷結果與B超監(jiān)測結果一致。
　　 結論