科凱恩綜合征的基因診斷和產(chǎn)前診斷及β-地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷.pdf

1、中國(guó)是個(gè)人口大國(guó)，人口基數(shù)大,人口增長(zhǎng)速度快，據(jù)統(tǒng)計(jì),平均每30秒就有一個(gè)缺陷兒出生。及時(shí)有效地查出這些出生缺陷的病因,從而采取有效的措施減少或避免這類患兒的出生,是我國(guó)及全世界面臨的一個(gè)大難題。引起出生缺陷的病因包括遺傳因素、環(huán)境因素、遺傳環(huán)境因素共同作用等。其中,遺傳因素所致的出生缺陷占總出生缺陷致病因素的25％。目前,減少或避免遺傳性出生缺陷的最有效的措施就是進(jìn)行遺傳診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。本研究通過對(duì)科凱恩綜合征家系致病基因的

2、闡明，探討罕見復(fù)雜遺傳病的遺傳診斷策略；針對(duì)β-地中海貧血基因突變高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，采用孕婦血漿胎兒游離DNA篩查四種常見父源性β-地中海貧血基因突變，探討β-地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷新方法。
　　第一部分、科凱恩綜合征的基因診斷和及產(chǎn)前診斷
　　目的：對(duì)一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育及精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、臨床表現(xiàn)疑似科凱恩綜合征家系的三姐妹患者進(jìn)行遺傳學(xué)分析，闡明基因突變位點(diǎn)，為其提供遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷服務(wù)。
　　方法:首先應(yīng)用體格檢查及

3、影像學(xué)檢查對(duì)該家系患者進(jìn)行初步臨床診斷，然后進(jìn)行生物化學(xué)和遺傳學(xué)檢測(cè)，包括內(nèi)分泌、肝腎功能、血糖檢測(cè)、串聯(lián)質(zhì)譜分析、染色體G顯帶核型分析、多重連接依賴探針擴(kuò)增、微陣列比較基因組雜交檢測(cè)、全基因外顯子組捕獲測(cè)序及Sanger測(cè)序。明確致病基因突變后，患者母親再次妊娠，于孕11+周經(jīng)腹絨毛膜活檢，抽取胎兒絨毛約20mg，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。
　　結(jié)果：
　　1.三姐妹染色體核型均為46，XX，內(nèi)分泌、生化檢測(cè)、串聯(lián)質(zhì)譜分析、

4、MLPA、微陣列比較基因組雜交分析結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)異常,頭顱MRI提示髓鞘發(fā)育不良。
　　2.全外顯子組捕獲測(cè)序：3個(gè)患者ERCC6基因均存在(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,complementation group6 gene) C.1595A>G及C.1607T>G兩個(gè)錯(cuò)義突變。
　　3.通過Sanger測(cè)序?qū)蚁党蓡T(包括全基因組外

5、顯子測(cè)序的3個(gè)患者和未患病的父母)進(jìn)行C.1595A及C.1607T兩個(gè)突變位點(diǎn)的測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)3個(gè)患者均存在兩個(gè)錯(cuò)義突變,父母均只有1個(gè)突變（其中自父親突變位點(diǎn)為c.1607T>G，母親突變位點(diǎn)為c.1595A>G）。
　　4.產(chǎn)前診斷：致病基因明確后，采用絨毛活檢技術(shù)抽取孕婦絨毛，進(jìn)行Sanger測(cè)序，證實(shí)胎兒僅遺傳了父源性的C.1607T>G突變，未遺傳母源性的C.1595A>G突變。
　　結(jié)論：
　　1.明確了

6、ERCC6基因的C.1595A>G及C.1607>G復(fù)合雜合突變是該生長(zhǎng)發(fā)育及精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩綜合征家系患者的致病原因，這是迄今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道的科凱恩綜合征基因突變新類型。
　　2.向該家系提供了準(zhǔn)確的遺傳咨詢服務(wù)，并成功實(shí)施了產(chǎn)前診斷。
　　3.利用序列捕獲技術(shù)對(duì)全基因外顯子區(qū)域 DNA捕獲并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序，相比第一代測(cè)序方法具有規(guī)模大、通量高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高（靈敏度99%、特異性99%）、時(shí)效性佳等一系列優(yōu)點(diǎn)，

7、可以檢測(cè)到外顯子區(qū)域的絕大部分疾病的相關(guān)變異，全基因組外顯子組測(cè)序是鑒定罕見、散發(fā)的復(fù)雜遺傳性疾病致病基因有效的策略。
　　4.早孕期經(jīng)腹絨毛活檢是一種相對(duì)安全、可靠的產(chǎn)前診斷技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)常見的染色體病和遺傳病的早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)，在避免缺陷兒出生的同時(shí)也可以減少孕中晚期引產(chǎn)帶來的生理及心理創(chuàng)傷、倫理壓力及并發(fā)癥，對(duì)于那些希望在孕早期做出準(zhǔn)確產(chǎn)前診斷的孕婦，早孕期經(jīng)腹絨毛活檢是比較理想的選擇。
　　第二部分、β-地中海貧血

8、的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷
　　目的：探討利用引物介導(dǎo)的限制性酶切聚合酶鏈反應(yīng)（primer-introduced restriction analysispolymerase chain reaction，PIRA-PCR）提高孕婦血漿胎兒父源性β珠蛋白基因突變的檢出率，為地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供參考。
　　方法:
　　1.用Primer5.0 軟件對(duì)中國(guó)常見的四種β地中海貧血基因突變（IVS-II-654(C→T),

9、CD17(A→T),-28(A→G)，CD41-42(-CTTT）進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì),將特異性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入到對(duì)應(yīng)的野生型所在的序列。
　　2.用打斷成小片段的健康成人外周血DNA樣本分別與同樣打斷成短片段的4種不同β珠蛋白基因突變[IVS-II-654(C→T),CD17(A→T),-28(A→G)，CD41-42(-CTTT）]的β地貧基因攜帶者DNA樣本混合，以人工模擬母體血漿中游離胎兒父源性β珠蛋白基因突變等位基因，

10、探討PIRA-PCR反應(yīng)和Sanger測(cè)序的最佳反應(yīng)條件。
　　3.收集10例孕育重型β地貧高風(fēng)險(xiǎn)胎兒孕婦外周血標(biāo)本，入選條件為丈夫?yàn)樯鲜?種β珠蛋白基因突變之一，且孕婦β珠蛋白基因突變類型與丈夫不同。分離孕婦外周血游離DNA，按模擬實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PIRA-PCR、PCR產(chǎn)物Sanger測(cè)序，篩查胎兒父源性β珠蛋白基因突變。
　　4.抽取上述10例孕婦羊水標(biāo)本，提取羊水基因組DNA，PCR-RDB闡明胎兒β-珠蛋白基

11、因突變類型。
　　5.將PIRA-PCR聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)孕婦外周血游離胎兒父源性β-珠蛋白基因突變的結(jié)果與羊水DNA PCR-RDBβ-珠蛋白基因突變檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以明確PIRA-PCR和Sanger氏測(cè)序法檢測(cè)母血游離DNA中胎兒父源性β珠蛋白基因突變的敏感性和特異性。
　　結(jié)果：
　　1.引物介導(dǎo)的限制性酶切聚合酶鏈反應(yīng)最低的有效模板濃度為0.2ng/uL,突變等位基因在PIRA-PCR的檢測(cè)的最低有效比例為3%

12、。
　　2.經(jīng)過PIRA-PCR特異性富集擴(kuò)增，父源性突變等位基因占總DNA的比例增加到50%。
　　3.10例孕婦外周血游離DNA PIRA-PCR聯(lián)合Sanger測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果包括：遺傳了父源性β-珠蛋白CD41-42(-CTTT)缺失基因的胎兒1例，遺傳了父源性β-珠蛋白CD17(A→T)突變基因的胎兒3例，遺傳了父源性β-珠蛋白IVS-II-654(C→T)突變基因的胎兒1例，遺傳了父源性β-珠蛋白-28(A→G)突

13、變基因的胎兒1例。未檢出父源性β-珠蛋白基因突變共4例。
　　4.10例孕婦羊水標(biāo)本PCR-RDB檢測(cè)結(jié)果：既遺傳了父源性β-珠蛋白突變又遺傳了母源性β-珠蛋白突變共4例，即βCD41-42（父）/βCD43(母）胎兒1例、βCD17(父）/βCD41-42（母）胎兒2例、βIVS-II-654(父）/βCD17（母）胎兒1例；僅遺傳了父源性β-珠蛋白突變基因2例 ，即βCD17（父）/βN胎兒1例、β-28（父）/βN胎兒1例；

14、僅遺傳了母源性β-珠蛋白突變基因的胎兒2例，β-珠蛋白基因正常的胎兒2例。
　　5.將用母血游離DNA PIRA-PCR結(jié)合Sanger測(cè)序檢測(cè)胎兒父源性β-珠蛋白基因突變結(jié)果與羊水DNA PCR-RDB檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明PIRA-PCR聯(lián)合Sanger測(cè)序檢測(cè)母血游離DNA中胎兒父源性β-珠蛋白基因突變的敏感性和特異性達(dá)100%。
　　結(jié)論：PIRA-PCR聯(lián)合Sanger測(cè)序檢測(cè)母血游離DNA中胎兒父源性β-珠蛋