手足裂畸形和遺傳性骨病的基因診斷和產(chǎn)前診斷.pdf

1、本研究包括兩個(gè)部分：一是對(duì)兩個(gè)中國人手足裂畸形家系進(jìn)行遺傳學(xué)致病機(jī)制的研究，確定致病基因位點(diǎn)，揭示手足裂畸形發(fā)病的細(xì)胞分子遺傳基礎(chǔ)，為患者及其家系成員提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)。二是對(duì)三種遺傳性骨病進(jìn)行致病基因突變位點(diǎn)的檢出，為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分手足裂畸形（split hand—foot malformation，SHFM）是由于四肢端骨正中軸的發(fā)育不良而剩余指(趾)呈不同模式的融合導(dǎo)

2、致的肢端畸形。
　　目的：對(duì)兩個(gè)中國人手足裂畸形家系，進(jìn)行遺傳學(xué)的研究，確定致病基因位點(diǎn)，揭示手足裂畸形發(fā)病的細(xì)胞分子遺傳基礎(chǔ)，為患者及其家系成員提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)。
　　方法:采集了家系1和家系2患者及配偶外周血和羊水標(biāo)本各兩份，一份外周血和羊水標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，行傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析。另一份外周血和羊水標(biāo)本用QIAGEN試劑盒提取基因組DNA，送美國耶魯大學(xué)行微陣列比較基因組雜交(array-based

3、 comparative genomic hybridization，Array-CGH)。
　　結(jié)果：兩家系共4份外周血及2份羊水標(biāo)本：家系1(I:1)(I:2)和家系2(I:1)(I:2)4份外周血染色體G顯帶核型分析未見異常。家系1(Ⅱ:3)羊水標(biāo)本G顯帶核型分析未見異常。家系2(Ⅱ:1)羊水標(biāo)本G顯帶核型分析示：46，XN,del(7)(q21q22.1)；微陣列比較基因組雜交（Array-CGH)分析結(jié)果：家系1(I:2

4、)外周血標(biāo)本及羊水標(biāo)本均示：662.3Kb dup（10q24.31-q24.32）。家系2(I:2)外周血標(biāo)本未見異常。家系2(Ⅱ:1)羊水標(biāo)本示：19.97Mb del(7q11.23-q21.3)。
　　結(jié)論：1.微陣列比較基因組雜交(Array-CGH)具有高通量和高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)傳統(tǒng)核型分析無法檢測(cè)到的亞顯微拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)。Array—CGH技術(shù)在診斷不平衡染

5、色體畸變方面具有其他分子生物學(xué)技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性，是傳統(tǒng)的 G顯帶核型分析技術(shù)的得力補(bǔ)充。2.明確662.3Kb dup（10q24.31-q24.32）和19.97Mb del(7q11.23-q21.3)是這兩個(gè)手足裂畸形家系的致病原因。并向兩個(gè)家系提供了準(zhǔn)確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)，并成功實(shí)施了產(chǎn)前診斷，避免了患兒的出生。
　　第二部分遺傳性骨病是一類臨床表型多樣和遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)的骨軟骨發(fā)育不良疾病，臨床表現(xiàn)包括身材矮小，

6、不成比例生長，畸形及單個(gè)或一組骨骼發(fā)育不良。本研究對(duì)遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT，MIM271600)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良（multiple epiphyseal dysplasia，MED，MIM132400）、軟骨發(fā)育不良(hypochondroplasia，HCH，MIM14600)三種遺傳性骨病家系分別進(jìn)行研究，在臨床診斷的基礎(chǔ)上，檢測(cè)致病基因，進(jìn)行致病基

7、因突變位點(diǎn)的檢出，為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷、及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　第一節(jié) X連鎖遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良基因基因診斷
　　目的：確定一個(gè)X-連鎖遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT)家系的基因突變類型。
　　方法：首先應(yīng)用體格檢查、影像學(xué)檢查和家系分析對(duì)該家系進(jìn)行臨床診斷。其次用酚-氯仿法從該家系3代12名成員的外周血中提取基

8、因組DNA，針對(duì)SEDL基因的第3-6外顯子及其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和一代DNA測(cè)序（Sanger測(cè)序），對(duì)基因片段進(jìn)行DNA序列分析查找突變位點(diǎn)。第三：用AMV-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取患者及攜帶者的外周血RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)PCR和Sanger測(cè)序，闡明該突變對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的影響。
　　結(jié)果:：基因組 DNA經(jīng) PCR及測(cè)序后證實(shí)：該家系中的患者均存在(c.IVS3+5G>C)突變，為突變半合子

9、；攜帶者為(c.IVS3+5G>C)突變雜合子?；颊叩?cDNA水平測(cè)序結(jié)果顯示 mRNA缺失了 Exon3序列，而攜帶者和正常人 mRNA中存在 Exon3序列。
　　結(jié)論：該 SEDT家系的致病突變是 SEDL基因(c.IVS3+5G>C)突變，該突變使轉(zhuǎn)錄水平上 mRNA的 Exon3缺失，進(jìn)而導(dǎo)致 Sedlin蛋白無表達(dá)或表達(dá)減少。
　　第二節(jié)多發(fā)性骨骺發(fā)育不良的基因診斷
　　目的：對(duì)一多發(fā)性骨髓發(fā)育不良（ME

10、D）女性患者進(jìn)行軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）基因突變分析。
　　方法：采集病人及正常人血樣，提取 DNA，用外顯子序列捕獲+第二代測(cè)序技術(shù)對(duì) COMP基因進(jìn)行基因突變檢測(cè)并用 PCR結(jié)合 Sanger DNA測(cè)序法對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：該患者 COMP基因外顯子9處存在 c.956A＞T點(diǎn)突變。
　　結(jié)論：1.該患者發(fā)病是由 COMP基因 c.956A＞T突變導(dǎo)致，其 COMP基因第319位密碼子由原來編碼天

11、冬氨酸的密碼子 GAC突變?yōu)榫幋a纈氨酸的密碼子 GTC，該突變國內(nèi)外未見報(bào)道，為一新突變。2.外顯子序列捕獲+第二代測(cè)序方法，能夠在一次試驗(yàn)中對(duì)多種基因進(jìn)行檢測(cè)，相比第一代測(cè)序方法（Sanger法），具有大規(guī)模、高通量、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高（靈敏度99％、特異性99%）和時(shí)效性高等一系列優(yōu)點(diǎn)。
　　第三節(jié)軟骨發(fā)育不良的基因診斷和產(chǎn)前診斷
　　目的：對(duì)一軟骨發(fā)育不良（HCH）家系進(jìn)行軟纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3）基因進(jìn)行

12、突變分析。
　　方法：采集患者、患者胎兒及正常人血樣，提取 DNA，用外顯子序列捕獲+第二代測(cè)序技術(shù)對(duì) FGFR3基因進(jìn)行基因突變的檢測(cè)并用 PCR結(jié)合 Sanger法進(jìn)行突變位點(diǎn)驗(yàn)證。
　　結(jié)果：患者及其胎兒均存在 FGFR3基因 c.1024G＞T突變。
　　結(jié)論：該患者及其胎兒患有 HCH，是由 FGFR3基因 c.1024G＞T突變所致。該突變使密碼子由 GGC轉(zhuǎn)變?yōu)?TGC，第342位的氨基酸由半胱氨酸替代了