河南省豬流行性腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查及CHHeN-ZZ株培養(yǎng)特性研究.pdf

1、2010年冬季以來，由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）在全國范圍內(nèi)爆發(fā)，對哺乳仔豬具有很高的致死率，造成哺乳仔豬腹瀉、嘔吐、脫水、最后衰竭而死，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究希望從 PEDV分子變異情況、血清學(xué)流行情況及生長特性等方面來解析河南省 PEDV流行狀況和病原學(xué)特征，為PEDV的綜合防

2、控提供依據(jù)。
　　1.為了解河南地區(qū)PEDV M基因和ORF3基因遺傳變異情況，對2012~2015年河南省不同豬場的16份PEDV陽性樣品的M基因和ORF3基因進(jìn)行克隆測序，分析其分子序列。結(jié)果如下：16個流行毒株的 M基因不存在核苷酸和氨基酸的缺失和插入；16個流行毒株的 M基因編碼的氨基酸同源性為96.9％~99.6%，與 CV777經(jīng)典毒株、韓國毒株及2010年以后國內(nèi)流行的大多數(shù)毒株的氨基酸同源性分別為97.4%~99.

3、1%、96.9%~99.6%和97.8%~99.6%；與CV777經(jīng)典毒株相比，除 CHHeN ZZ-2012(ZZ)毒株外的15株流行毒株在第13個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變（E-Q/L）。16個流行毒株中 CHHeN DF2-2012(DF2)和CHHeN DF2-2012（ZZ）毒株的ORF3基因存在49個核苷酸缺失，與CV777疫苗株核苷酸同源性為100%；與 CV777經(jīng)典毒株相比，2株缺失毒株存在13個核苷酸位點(diǎn)和5個氨基酸位點(diǎn)的

4、一致突變。其余14個流行毒株相互間氨基酸同源性為98.1%~100%，與 CV777經(jīng)典毒株、CV777疫苗株和韓國毒株氨基酸同源性分別為95.1%%~96.0%、90.2%%~91.1%和97.3%~99.1%，與2010年以后國內(nèi)流行的大多數(shù)毒株氨基酸同源性為97.3%~99.6%；與 CV777經(jīng)典毒株相比，14個流行毒株的核苷酸和氨基酸一致突變位點(diǎn)分別為19個和8個。進(jìn)化樹分析顯示，M基因可分為4個群，河南 PEDV流行毒株主要

5、以基因3群為主，其中 ZZ毒株屬于基因2群；ORF3基因分為3個群，DF2毒株和 ZZ毒株分布于基因2群，其余14個毒株屬于基因3群。表明當(dāng)前河南主要流行的PEDV毒株的M基因和ORF3基因與2010年以后國內(nèi)流行的大多數(shù)毒株同源性較高，與韓國毒株親緣關(guān)系較近；與經(jīng)典毒株和疫苗株相比，其 M基因和 ORF3基因發(fā)生了變異。
　　2.將原核表達(dá)純化后的PEDV N蛋白作為包被抗原，建立了PEDV間接ELSIA方法，并利用該方法對河南

6、省200份臨床血清進(jìn)行檢測。經(jīng)組分及條件優(yōu)化，確定包被抗原濃度為0.5μg/mL，0.5% Casein4℃封閉過夜，血清最佳稀釋倍數(shù)為1：100，37℃作用60 min，二抗?jié)舛葹?:20000，37℃作用60 min，血清臨界值 S/P≥0.262，判為陽性，S/P＜0.247判為陰性，介于兩者之間判為可疑。該方法對豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬及豬口蹄疫陽性血清檢測結(jié)果均為陰性。批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在2.22%~4.21

7、%和3.06%~10.81%。與商品化試劑盒相比，相對靈敏性和相對特異性及二者符合率分別為95.00%、97.22%和95.83%。200份臨床血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 PEDV的陽性率為66.00%，其中，發(fā)病豬場陽性率為70.00%，免疫豬場陽性率為85.00%，未免豬場陽性率為15.00%；母豬抗體陽性率為68.30%，仔豬和育肥豬抗體陽性率分別為33.33%和56.7%。本研究建立的間接 ELISA方法具有較好的特異性、靈敏性和重

8、復(fù)性，可用于 PEDV抗體檢測及流行病學(xué)調(diào)查；對200份河南省 PEDV血清檢測結(jié)果顯示河南省 PEDV抗體陽性率較高，但仔豬抗體陽性率較低，需加強(qiáng)防護(hù)和綜合防控。
　　3、為研究PEDV的分離培養(yǎng)特性，本研究將鑒定為 PEDV陽性的仔豬腸內(nèi)容物處理之后，接種于 Vero細(xì)胞上，在不含血清的病毒維持液中加入終濃度為10μg/mL的胰酶，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行 RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光（IFA）鑒定和基因序列測定；對 PE

9、DV分離株的細(xì)胞培養(yǎng)，增值規(guī)律及穩(wěn)定傳代等培養(yǎng)特性進(jìn)行研究；采用固定病毒-稀釋血清的方法，對不同臨床背景血清進(jìn)行抗體中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示：將病毒接種 Vero細(xì)胞盲傳至第7代，出現(xiàn) CPE病變，隨著代次增加，CPE出現(xiàn)時間變短，呈現(xiàn)規(guī)律性變化，RT-PCR鑒定為陽性，IFA檢測可見特異性熒光，S1、M、ORF3基因測序結(jié)果為 PEDV對應(yīng)基因片段，確認(rèn)分離到一株 PEDV（CHHeN-ZZ）。通過 FQ-PCR，繪制胞內(nèi)、胞外病毒一步生長

10、曲線，胞內(nèi)病毒含量0 h~12 h逐步上升，12 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降，48 h下降幅度突然增大；胞外病毒24 h~72 h出現(xiàn)快速增加，72 h左右達(dá)到峰值，之后開始逐步下降。PEDV從第20代到第50代，TCID50穩(wěn)定在10-5.5~10-6.2/0.1mL之間，現(xiàn)已傳至50代，TCID50值為10-6.11/0.1mL；對不同代次分離毒株的M基因和S1基因進(jìn)行序列分析，第7代與第50代之間的核苷酸同源性分別為99.6%~99

11、.9%、99.8%~99.9%；分離毒株S1基因與CV777疫苗株同屬于基因Ⅰ群，利用分離毒株進(jìn)行抗體中和試驗(yàn)顯示：臨床上未曾免疫但感染過基因ⅢⅢ群 PEDV的豬場血清中和抗體效價滴度幾乎為零，而疫苗免疫豬場血清中和抗體效價在54.1~74.9。本研究成功分離一株 PEDV毒株，生長特性良好，能在細(xì)胞上穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。通過抗體中和試驗(yàn)，證明 CV777疫苗株所在基因Ⅰ群毒株與基因Ⅲ群流行毒株之間的免疫交叉性差。通過分離培養(yǎng) PEDV CH