人肺癌MAGE12基因的克隆及其表達(dá)的初步研究.pdf

1、隨著分子免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，人們對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有了深入的了解，認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多階段、多步驟的漸進(jìn)過(guò)程，但尚未找到腫瘤的特異突變或缺陷基因，人類腫瘤特異性免疫治療的重要物質(zhì)基礎(chǔ)是腫瘤特異性抗原的存在。 1991 年 van der BrlJggen 等<'[1]>發(fā)現(xiàn)黑色素瘤抗原(melarloma antigen，MAGE)MAGE-1以來(lái)，MAGE家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少包括MAGE-A、B、C、

2、D、E、F六個(gè)亞家族。MAGE-12基因?qū)儆诤谏亓隹乖?MAGE)家族中一員，MAGE-12是1994年Ding M等<'[2]>在人黑色素瘤細(xì)胞系DM150中被發(fā)現(xiàn)，且MAGE-12與MAGE-2、MAGE-3有高度的同源性，研究發(fā)現(xiàn)MAGE-12基因在肺癌細(xì)胞中有較高的表達(dá)率<'[3-5]>。MAGE-12基因編碼一種腫瘤特異性抗原，在黑色素瘤、肺癌等其他多種腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，而在正常組織中除睪丸和胎盤(pán)外均不表達(dá)，MA

3、GE基因的發(fā)現(xiàn)立即成為腫瘤生物學(xué)治療的熱點(diǎn)。 綠色熒光蛋白(GFP)是上世紀(jì)九十年代中期發(fā)展起來(lái)的一種全新的報(bào)告分子<'[6]>，最初是從多管水母(Aequoreavictoria)中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，GFP能在多種生物，如細(xì)菌、粘菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物中表達(dá)并產(chǎn)生熒光<'[7]>GFP分子量小，易于其它目的基因形成融合基因，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，而且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，使用方便，可以在活體細(xì)胞中定時(shí)觀察，所以連接有GFP的載體pEG

4、FP-LC3在分子生物學(xué)中被廣泛應(yīng)用。 目的 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從人肺癌組織中擴(kuò)增得到MAGE-12基因；構(gòu)建MAGE-12基因的克隆載體 pGEM-T easy-MAGE-12及綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C3-MAGE-12，并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞 (食管癌Eca109細(xì)胞)，觀察其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，為制備 MAGE-12基因疫苗，并將其用于腫瘤的免疫治療打下基礎(chǔ)。 材料與方法 1．提取肺癌組織

5、中的總 RNA，應(yīng)用 RT-PCR方法，從中逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出MAGE-12 cDNA基因片段，再PCR擴(kuò)增得到MAGE-12基因片段，經(jīng)過(guò)酶切鑒定后，克隆至載體 pGEM-T easy，構(gòu)建MAGE基因克隆載體 pGEM-Teasy-MAGE-12，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌JM109后，進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑選陽(yáng)性克隆送上海生物工程公司進(jìn)行行序列分析。 2．測(cè)序證實(shí)堿基序列無(wú)誤后，雙酶切克隆載體 pGEM-MAGE-12及真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體

6、 pEGFP-C3，構(gòu)建MAGE12基因真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C3-MAGE-12，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109菌。 3．挑選陽(yáng)性菌落經(jīng)酶切鑒定無(wú)誤后，提取重組表達(dá)載體pEGFF-C3-MAGE-12，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞(食管癌Eca109細(xì)胞)，在熒光顯微鏡下觀察其在真核細(xì)胞中表達(dá)情況。 4．提取轉(zhuǎn)染有重組表達(dá)載體pEGFF-C3-MAGE-12真核細(xì)胞內(nèi)總mRNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，鑒定MAGE

7、-12基因在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果 1．以cDNA為模板，MAGE-12的兩對(duì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，所得到的條帶位于對(duì)照DNA marker近1000bp條帶處，于預(yù)期的944bp的目的基因大小接近。經(jīng)酶切鑒定，理論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。 2．構(gòu)建出 MAGE 基因克隆載體 pGEM-T easy-MAGE-12。挑選陽(yáng)性克隆，送生物工程公司測(cè)序后所獲目的基因的序列，

8、經(jīng)計(jì)算機(jī)分析證實(shí)，與基因庫(kù)中MAGE-12基因的2960—3904bp片段堿基序列完全一致。 3．構(gòu)建出MAGE-12基因真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體 pEGFP-C3-MAGE-12，經(jīng)雙酶切鑒定后，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，能夠在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)。 4．經(jīng)RT-PCR技術(shù)證實(shí)MAGE-12基因在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。 結(jié)論 1．從人肺癌組織中成功擴(kuò)增出MAGE-12基因，并構(gòu)建MAGE-12基因克隆質(zhì)粒 pG