綠粘帚霉和球孢白僵菌原生質(zhì)體制備、再生和融合條件的研究.pdf

1、綠粘帚霉(Gliocladium virens)是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，球孢白僵菌(Beauveria vuillenun)是綠色環(huán)保型生物殺蟲菌，兩者的原生質(zhì)體融合屬于不同屬之間的原生質(zhì)體融合，隨著生物技術(shù)和基因工程的深入發(fā)展，不同屬之間的原生質(zhì)體融合頻頻獲得成功，這為綠粘帚霉和球孢白僵菌原生質(zhì)體融合提供了可行性。 本文擬以綠粘帚霉F051(以下簡稱F051)和球孢白僵菌為出發(fā)菌株，試圖通過用PEG6000作為助融劑使

2、處于對數(shù)生長期的：F051和球孢白僵菌的原生質(zhì)體融合，結(jié)合抗藥性及滅活單一親本的方法在選擇性再生培養(yǎng)基上篩選出具有治病和殺蟲雙重作用的生防工程菌，實驗結(jié)果如下： 1、F051和球孢白僵菌采用菌絲干重法測定生長曲線，結(jié)果顯示，F(xiàn)051培養(yǎng)20h后進(jìn)入對數(shù)生長期，一直持續(xù)到28h，而球孢白僵菌培養(yǎng)70h才進(jìn)入對數(shù)生長期，并且持續(xù)到80h才結(jié)束。 2、利用單因素實驗探討F051和球孢白僵菌原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生的最佳條件，結(jié)果是：

3、 (1)F051：用培養(yǎng)基A培養(yǎng)F051分生孢子24h，MgSO<,4>0.6 mol/L(再生用蔗糖0.6 mol/L)，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為緩沖系統(tǒng)，纖維素酶：蝸牛酶：溶菌酶=4mg/mL：2：mg/mL：2 mg/mL，在32℃水浴中酶解2h。 (2)球孢白僵菌：用L-broth培養(yǎng)基培養(yǎng)球孢白僵菌分生孢子78h，KCl 0.8 mol/L，(再生用蔗糖0.6 mol/L)，檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液為緩沖系統(tǒng)，

4、纖維素酶：蝸牛酶：溶菌酶=5mg/mL：2.5。mg/mL：2.5mg/mL，在32℃水浴中酶解3h。 3、選用7種農(nóng)藥分別對F051和球孢白僵菌進(jìn)行抗藥性測定，鑒于F051和球孢白僵菌對多菌靈敏感程度差別較大，最終選擇多菌靈作為抗性鑒定用農(nóng)藥，并確定120μg/mL多菌靈濃度為標(biāo)記濃度。 4、對球孢白僵菌原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活處理，并測定了溫度和時間兩個因素對致死率的影響，結(jié)果表明，55℃以上水浴中處理90min,65℃水

5、浴中處理60min以上都會使原生質(zhì)體全部失活不能再生出任何菌落，最后我們選擇55℃處理90min作為失活條件。 5、測定了標(biāo)記濃度和熱滅活條件分別對F051和球孢白僵菌出發(fā)菌株原生質(zhì)體突變率的影響，排除了突變株對融合菌株的干擾。 6、對融合子再生培養(yǎng)基進(jìn)行了初篩，最后確定用改良的YEPD培養(yǎng)基為融合子再生培養(yǎng)基。 7、以30％PEG6000+0.01mol/L CaCl<,2>作為助融劑，在32℃水浴中進(jìn)行融合，