黃粉蟲抗菌肽的誘導(dǎo)、生物學(xué)活性測定及初步分離純化.pdf

1、本文通過采用不同的誘導(dǎo)方法對黃粉蟲進(jìn)行誘導(dǎo)，分別采用了紫外線誘導(dǎo)法、超聲波誘導(dǎo)法、針刺誘導(dǎo)法、菌液浸泡誘導(dǎo)法、饑餓誘導(dǎo)法、菌液注射誘導(dǎo)法等方法；每種誘導(dǎo)方法分別采用不同劑量或不同的誘導(dǎo)時間，且誘導(dǎo)后分別培養(yǎng)不同的時間，之后取其血淋巴并通過進(jìn)行抑菌圈試驗確定其是否已經(jīng)產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，若產(chǎn)生則觀察其抗菌活性的強(qiáng)弱。試驗得出在不同的誘導(dǎo)方法中采用菌液注射的方法注射1.0μl/頭、誘導(dǎo)后培養(yǎng)48h效果最好；其次為菌液浸泡誘導(dǎo)法和饑餓誘導(dǎo)法；另

2、外幾種誘導(dǎo)方式雖有一定的抑菌效果但不顯著。本試驗中同時對不同誘導(dǎo)方法分別采用了不同的誘導(dǎo)后培養(yǎng)時間，分別為24h、48h、72h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后培養(yǎng)不同的時間，其血淋巴的抑菌活性也存在很大差異，以48h為最佳；若小于48h，在蟲體內(nèi)并沒有完全形成系統(tǒng)有效的防御機(jī)制，因而抑菌活性不理想；若大于48h，菌液在蟲體內(nèi)存留太長時間，且菌的繁殖速度很快，以致于大部分供試蟲體防御系統(tǒng)的形成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菌在體內(nèi)生長的速度，造成蟲體萎靡不振、活動力下降

3、、血淋巴提取量減少，甚至使供試黃粉蟲死亡，也不利于觀察其抑菌活性。本文首次對多種誘導(dǎo)方法進(jìn)行了詳細(xì)比較，從而篩選出較優(yōu)的誘導(dǎo)方法。 以最佳誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)后取血淋巴進(jìn)行抗菌肽生物學(xué)活性的測定。分別進(jìn)行了對熱穩(wěn)定性、反復(fù)凍溶的穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性、pH值及有機(jī)溶劑對抗菌肽抑菌活性影響的測定。試驗結(jié)果為：黃粉蟲抗菌肽有較好的熱穩(wěn)定性，在90～100℃處理10min后仍有較好的抑菌效果；經(jīng)反復(fù)凍溶后，抑菌圈直徑均有一定程度的減小，但凍溶4

4、次以下差異無顯著性、凍溶6～10次，抑菌活性與對照相比差異達(dá)顯著性水平，但仍可觀察到抑菌效果；經(jīng)胰蛋白酶及胃蛋白酶作用后抗菌肽的抑菌率均有所下降，而蛋白酶K對其抑菌活力影響不大；pH值在5.0-9.0范圍內(nèi)，抑菌活性雖有一定程度的下降但均不能造成其抗菌活性的喪失，而在pH<5或pH>9的環(huán)境條件下抑菌活性會受到很大影響或不表現(xiàn)活性；甲醇、正丁醇對抗菌肽的抑菌活性無顯著影響，乙醇、氯仿、異丙醇對抗菌肽的抑菌活性有一定影響。通過以上結(jié)果得出

5、結(jié)論：黃粉蟲抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性、在低溫反復(fù)凍融后仍保持有較高的活性、經(jīng)蛋白酶作用后抗菌肽的抑菌活性有所下降；另外PH值、有機(jī)溶劑作用也對抗菌肽的抑菌活性產(chǎn)生或多或少的影響。 用凝膠過濾層析分離純化血淋巴中抗菌肽，以大腸桿菌為指示菌種，抗菌活性測定的結(jié)果表明，經(jīng)Sephadex G50凝膠過濾柱層析分離后得到2個較明顯的活性峰，結(jié)果顯示從收集的第5管至第19管均有抑菌活性，說明收集物是由多種成分混合在一起的，因而說明分離的并

6、不徹底。將Sephadex G50分離后有活性的部分合并在一起，濃縮后經(jīng)Sephadex G25凝膠過濾柱層析分離得到3個活性峰，表明黃粉幼蟲血淋巴中有多個抗菌肽組分。如何分離純化到單體還有待于進(jìn)一步研究。 本試驗是黃粉蟲抗菌肽進(jìn)一步分離純化研究的基礎(chǔ)；并對如何更有效更便捷的誘導(dǎo)黃粉蟲使其產(chǎn)生抗菌肽首次進(jìn)行了詳細(xì)的比較與篩選，從而確定了一種較優(yōu)較合理的誘導(dǎo)方法；另外，通過對其生物學(xué)特性的研究與分析，為更好的保存及合理的利用和研究