黑水虻抗菌肽分離純化及活性成分對(duì)CNE2細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目的：從黑水虻幼蟲(chóng)血淋巴中分離純化抗菌肽，篩選抗菌肽活性組分。探討黑水虻抗菌肽活性組分對(duì)鼻咽癌（CNE2）細(xì)胞的影響及其機(jī)制，為挖掘黑水虻抗菌肽醫(yī)藥研發(fā)價(jià)值提供理論依據(jù)。
　　方法：(1)利用金黃色葡萄球菌針刺誘導(dǎo),提取抗菌肽粗提物，利用 Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)后黑水虻幼蟲(chóng)血淋巴中小分子抗菌肽的存在，藥敏紙片法檢測(cè)抗菌肽粗提物的抑菌效果；利用RP-HPLC法對(duì)抗菌肽粗提物進(jìn)行分離純化，并收集各純化峰對(duì)應(yīng)組分，

2、測(cè)定各純化峰對(duì)應(yīng)組分的抑菌效果，篩選出具有抑菌活性的單一組分，并測(cè)定活性組分的MIC值。(2)采用 CCK-8法檢測(cè)各組分對(duì) CNE2細(xì)胞體外增殖的影響，篩選出抑癌活性組分，采用 RP-HP LC法檢測(cè)抑癌活性組分的純度。(3) Hoechst33342染色法檢測(cè)抑癌活性組分對(duì) CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響；FCM法檢測(cè)抑癌活性組分對(duì) CNE2細(xì)胞凋亡率的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑癌活性組分對(duì)CNE2細(xì)胞遷移的影響。(4) RT-PCR法檢測(cè)抑

3、癌活性組分對(duì) CNE2細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因表達(dá)的影響；Western blotting法檢測(cè)抑癌活性組分對(duì)CNE2細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)通過(guò)Tricine-SDS-PAGE電泳及 RP-HPLC法分離純化得到黑水虻抗菌肽3個(gè)組分（HI-1、HI-2、HI-3），藥敏紙片法檢測(cè)結(jié)果表明，僅組分HI-3（以下稱(chēng)抗菌肽 HI-3）有抑菌活性，其對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和

4、產(chǎn)氣腸桿菌均有抑菌活性，MIC分別為80μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、80μg/ml。(2)抗菌肽 HI-3可有效抑制 CNE2細(xì)胞體外增殖，抑制率達(dá)到40.56±6.80％，與 HI-1（4.38±0.33%）和 HI-2（4.16±0.14%）組相比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），抗菌肽HI-3對(duì)HUV-C細(xì)胞抑制作用不明顯，抑制率僅為4.65±1.45%，通過(guò)RP-HPLC分析抗菌肽HI-3的純度為96.1%。

5、(3)抗菌肽HI-3可增加CNE2細(xì)胞膜通透性，當(dāng)濃度為160μg/ml時(shí)可觀察到 CNE2細(xì)胞有典型的凋亡現(xiàn)象，早期凋亡率可達(dá)27.59±1.14%；但抗菌肽HI-3未改變HUV-C細(xì)胞膜通透性，早期凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？咕?HI-3可降低 C N E2細(xì)胞的遷移能力， HI-3處理組在12h、24 h和48 h的遷移率分別為24.43±0.47%、61.51±0.04%和80±1.46%，與相同時(shí)段的陰性對(duì)照組相比較，

6、遷移率顯著降低（P<0.05）。(4)抗菌肽 HI-3處理組端粒酶活性明顯低于陰性對(duì)照組， hTERT基因表達(dá)量及蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：(1)黑水虻幼蟲(chóng)可經(jīng)金黃色葡萄球菌針刺誘導(dǎo)在其血淋巴中產(chǎn)生具有抑菌活性的小分子多肽物質(zhì)（HI-3），其對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有一定的抑制作用；(2)抗菌肽 HI-3可有效抑制 CNE2細(xì)胞的體外增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡并降低其遷移力，但對(duì)正常細(xì)胞 HUV-C