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文檔簡介
1、目的:
觀察內(nèi)皮祖細胞(EPC)在不同濃度血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用下的生物學(xué)特性,探討VEGF對EPC生物學(xué)特性的影響。
方法:
無菌條件下分離脛骨和股骨,M199培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集沖洗液充分吹打混勻,加入裝有密度梯度為1.077 g/cm3的淋巴細胞分離液的離心管,沖洗液與分離液的體積比為2∶1。20℃下2000r/minFicoll-Histopaque梯度離心沉淀20min。吸
2、取中間乳白色云霧狀單個核細胞層,PBS沖洗細胞沉淀。以1×106/ml的密度接種到100ml培養(yǎng)瓶中。含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后重新接種未貼壁細胞。第3天半量換液,第5天全量換液。細胞達到80%以上融合時,用0.25%胰酶(含1%EDTA)消化細胞。在第7天運用流式細胞儀行細胞表型CD133、CD34鑒定。收集貼壁細胞并計數(shù),將等量EPC懸液200μl接種到96孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)2
3、d,用不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,換含有不同濃度(0、10、50ng/ml)VEGF的培養(yǎng)液,每個濃度組重復(fù)5孔,培養(yǎng)24h后,每孔加MTT(5 g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸棄上清液,再加入DMSO(150μl/孔),水平振蕩10min后置于酶標儀波長560nm處,取5個孔吸光值(optical density OD)的平均值,得到最適濃度。以最適濃度按上述方法培養(yǎng),以培養(yǎng)時間為橫坐標、OD值為縱坐標,繪制細胞生長
4、曲線。應(yīng)用24孔的Transwell(孔徑8μm)小室行體外遷移實驗。上室為200μl EPC(1×104/ml)懸液,下室為含不同濃度(0、10、50 ng/ml)VEGF的M199培養(yǎng)液。37℃下培養(yǎng)24h,將上室附著細胞用濕棉簽擦去,固定,Giemsa染色,脫色,拍照(×200),實驗重復(fù)3次。倒置顯微鏡計數(shù)遷移細胞。體外血管生成能力檢測:應(yīng)用纖維蛋白凝膠行體外血管生成實驗。96孔培養(yǎng)板每孔依次加30μl人纖維蛋白原與20μl凝血
5、酶,晃勻,37℃30min成凝膠;加入5×103細胞懸液培養(yǎng)過夜;去除培養(yǎng)液,依次加30μl人纖維蛋白原與20μl凝血酶,晃勻,加100μl培養(yǎng)液,24h。顯微鏡觀察血管生成,隨機選取3個視野(×200)計數(shù)血管數(shù)目。原代細胞培養(yǎng)至第4天時,換用含不同濃度(10和50ng/ml)VEGF的M199培養(yǎng)液,培養(yǎng)1d后,運用流式細胞儀進行檢測。將貼壁細胞用胰酶消化后,PBS反復(fù)吹打制成單細胞懸液,2000r/min離心5min,將細胞置于5
6、0μlPBS中,制成單細胞懸液。加入CD31直標抗體,4℃孵育60min。PBS洗滌重懸后立即在避光條件下進行流式細胞檢測,計數(shù)1×104個細胞。同型對照一抗為PBS,其余操作同上。統(tǒng)計CD31+細胞的百分率,應(yīng)用WinMDI2.9軟件進行分析。
結(jié)果:
培養(yǎng)7d的細胞CD133和CD34陽性率分別為69.44%和81.0596。MTT實驗顯示,10ng/ml組細胞的OD值明顯大于0ng/ml組和50ng/m
7、l組,0ng/ml組的OD值明顯大于50ng/ml組(P<0.05);遷移實驗、體外血管形成實驗及誘導(dǎo)分化實驗顯示,50ng/ml組和10ng/ml組較0ng/ml組更能促進EPC的遷移、體外血管形成及誘導(dǎo)分化,且50ng/ml組強于10ng/ml組(P<0.05)。
結(jié)論:
VEGF能夠提高EPC遷移能力、體外血管形成能力及促進誘導(dǎo)分化,且隨著VEGF濃度的升高而增強。VEGF能夠提高EPC增殖能力,但隨著
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