髓系惡性腫瘤始動(dòng)細(xì)胞拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分不同危險(xiǎn)程度骨髓增生異常綜合征患者CD34+細(xì)胞差異性表現(xiàn)衰老特征
　　目的:評(píng)估骨髓增生異常綜合征(MDS)患者CD34+細(xì)胞的衰老表現(xiàn)和程度,探討這種衰老現(xiàn)象與氧化應(yīng)激-DNA損傷-p38MAPKα(p38)信號(hào)通路激活的關(guān)系。
　　方法:從47例MDS患者,14急性髓系白血病(AML)患者和12例健康志愿者的骨髓細(xì)胞中分選出CD34+細(xì)胞,檢測(cè)衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶

2、抑制因子p21CIP1/WAF1(p21)的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)這群細(xì)胞的衰老表現(xiàn),分別用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光、蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)、DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX和p38的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照相比,不論是骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)群體還是CD34+細(xì)胞,SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例和p21的基因表達(dá)在相對(duì)低危組(lower-risk)MDS組均明顯增高(P<0

3、.01),SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例與患者國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS)呈負(fù)相關(guān);ROS積聚和γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例在BMMNCs、CD34+細(xì)胞水平各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但兩者在CD34+CD38-細(xì)胞水平呈相互關(guān)聯(lián)性升高(P<0.05),對(duì)照組　　

4、結(jié)論:在包含干/祖細(xì)胞或MDS始動(dòng)細(xì)胞的CD34+細(xì)胞群體,MDS相對(duì)低危組患者有明顯增多的衰老細(xì)胞,這在無(wú)效造血或抵抗轉(zhuǎn)化白血病方面可能起到一定作用,而此作用不完全依賴于ROS-p38信號(hào)通路;而MDS相對(duì)高危組患者的CD34+細(xì)胞沒有明顯衰老表現(xiàn),表明其突破了阻礙其向AML轉(zhuǎn)化的衰老屏障。
　　第二部分P38MAPKα低水平磷酸化阻礙髓系白血病CD34+CD38-細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老
　　目的:研究髓系白血病CD3

5、4+CD38-細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)-DNA損傷-P38MAPKα(p38)-細(xì)胞衰老這一在造血干細(xì)胞(HSCs)中的經(jīng)典應(yīng)激性衰老通路的信號(hào)分子激活情況。
　　方法:從11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞和KG1a、K562細(xì)胞系中分選出CD34+CD38-細(xì)胞,比較它們與正常臍血CD34+CD38-細(xì)胞的ROS-DNA損傷-p38-細(xì)胞衰老信號(hào)通路激活情況。以KG1a、K5

6、62細(xì)胞系的CD34+CD38-細(xì)胞為研究對(duì)象,異常激活p38,觀察它們的細(xì)胞增殖、周期、衰老、凋亡的變化。
　　結(jié)果:髓系白血病患者和KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞的ROS聚積和DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX水平明顯高于正常臍血HSCs和用H2O2刺激而誘導(dǎo)衰老的臍血HSCs,而p38的磷酸化水平卻相對(duì)不足;迫使KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞的p38高水平磷酸化后,細(xì)胞發(fā)生衰老樣改變、細(xì)胞周

7、期阻滯和凋亡。
　　結(jié)論:在包含髓系白血病始動(dòng)細(xì)胞的CD34+CD38-群體中,p38磷酸化水平的相對(duì)不足,是解聯(lián)細(xì)胞內(nèi)ROS聚積誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和/或凋亡的重要原因。
　　第三部分MicroRNA-34c誘導(dǎo)髓系白血病CD34+CD38-細(xì)胞衰老樣改變
　　目的:研究miR-34c在髓系白血病CD34+CD38-細(xì)胞中的表達(dá),它是否能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,是否受ROS-p38信號(hào)調(diào)控及其在髓系白血病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　

8、方法:從11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞和KG1a、K562細(xì)胞系中分選出CD34+CD38-細(xì)胞,用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miR-34c的表達(dá)水平;用p38激活劑使KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞的p38高水平磷酸化,觀察miR-34c表達(dá)水平的變化;用miR-34c的類似物轉(zhuǎn)染KG1a、K562的CD34+CD38-細(xì)胞,使其高水平表達(dá)miR-34c,觀察細(xì)胞

9、增殖、周期、衰老、凋亡的變化和其下游靶蛋白的表達(dá)水平變化;運(yùn)用KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型,通過(guò)觀察小鼠的體重變化,生存狀態(tài)、腫瘤負(fù)荷,研究miR-34c在AML發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果:與正常臍血CD34+CD38-細(xì)胞相比,髓系白血病患者和KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞的miR-34c的表達(dá)明顯下降;KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞的miR-34c表達(dá)隨p38的磷酸化而增強(qiáng);

10、轉(zhuǎn)染miR-34c類似物后,通過(guò)下調(diào)多種下游靶蛋白(e2f3,cyclin-E,c-myc,CDK4)使KG1a、K562細(xì)胞系CD34+CD38-細(xì)胞呈現(xiàn)衰老樣改變和細(xì)胞凋亡;miR-34c類似物注入KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型后能使小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng),腫瘤負(fù)荷減輕,從而阻礙AML的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論:miR-34c是誘導(dǎo)髓系白血病CD34+CD38-細(xì)胞衰老樣改變的重要小分子,它在髓系白血病中的低水平表達(dá)是白血