基于改造茉莉酸甲酯生物合成途徑的丹參次生代謝工程新策略.pdf

1、植物次生代謝產(chǎn)物是植物為了抵御外界刺激如微生物入侵與昆蟲、食草動(dòng)物傷害等脅迫而產(chǎn)生的化合物，如抗生素、生物堿、毒素等。許多次生代謝產(chǎn)物具有很好的藥理活性，是中藥和天然植物藥的主要有效成分。在外界生物或非生物的壓力脅迫下，一些植物激素，如脫落酸、水楊酸、乙烯以及茉莉酸甲酯(MeJA)等在植物中大量積累，通過(guò)相互作用，調(diào)控植物的信號(hào)傳遞、脅迫耐受以及次生代謝等過(guò)程，形成植物的應(yīng)激系統(tǒng)。其中，茉莉酸甲酯在植物應(yīng)激反應(yīng)和次生代謝調(diào)控中起著至關(guān)重

2、要的作用。目前，MeJA作為外源誘導(dǎo)子促進(jìn)植物次生代謝物的過(guò)量積累，已得到廣泛應(yīng)用。本研究探索一種新的代謝工程策略，通過(guò)過(guò)量表達(dá)植物MeJA合成途徑上的關(guān)鍵酶基因，提高內(nèi)源MeJA的含量，進(jìn)而刺激多種次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。為了使這種新策略應(yīng)用于多種植物，節(jié)省大量克隆內(nèi)源基因的工作。本研究同時(shí)將內(nèi)源和異源基因在植物中過(guò)量表達(dá)，考察是否達(dá)到同樣的效果。
　　 在植物的茉莉酸甲酯生物合成途徑中，丙二烯氧化物環(huán)化酶allene ox

3、ide cycalse(AOC)和茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)運(yùn)酶jamonic acid carboxyl methyltransferase(JMT)是重要的關(guān)鍵酶。本研究采用RACE方法，從丹參中克隆了AOC基因(SmAOC，GenBank登錄號(hào)：HM156740)，其cDNA全長(zhǎng)為910bp，開放閱讀框(ORF區(qū))編碼的蛋白質(zhì)共有245個(gè)氨基酸。該基因與其他物種中的AOC基因具有較高的同源性，與水稻OsAOC的相似度為75％，與玉米ZmAOC

4、的相似度為74％。器官組成型分析，SmAOC在丹參中根莖葉均有分布，葉中表達(dá)量最高。Southern雜交結(jié)果顯示SmAOC在丹參中是一個(gè)低拷貝基因；RT—QPCR分析顯示AOC基因表達(dá)可被多種不同的誘導(dǎo)因素，如：茉莉酸甲酯、紫外線照射、低溫脅迫所誘導(dǎo)，而提高表達(dá)水平。原核表達(dá)SmAOC，SDS—PAGE電泳檢測(cè)得到了預(yù)期表達(dá)的目的蛋白。耐鹽脅迫試驗(yàn)表明，表達(dá)SmAOC蛋白的細(xì)菌比對(duì)照更耐受高鹽環(huán)境。
　　 丹參中兩大類活性成分主

5、要是以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性二萜醌類化合物和以丹參酚酸B為代表的水溶性化合物。在根癌農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的丹參發(fā)根中分別過(guò)量表達(dá)MeJA合成途徑中的關(guān)鍵酶：內(nèi)源的丹參SmAOC，異源的莨菪HnAOC和擬南芥AtJMT，結(jié)果顯示在各轉(zhuǎn)基因事件中，上述兩類化合物的含量基本上均比對(duì)照有不同程度提高。在所有轉(zhuǎn)基因株系中。轉(zhuǎn)SmAOC組的S—7株系丹參酮ⅡA提高最多，達(dá)到野生發(fā)根的16．6倍，干重含量從0．037mg/g提高到0．56mg/g；

6、轉(zhuǎn)AtJMT組的J—5株系隱丹參酮提高最多，達(dá)到野生發(fā)根的16．8倍，干重含量從0．027mg/g提高到0．46mg/g；轉(zhuǎn)HnAOC組的H—11株系迷迭香酸提高最多，達(dá)到野生型對(duì)照的2．19倍，干重含量從1．32mg/g提高到2．89mg/g；轉(zhuǎn)SmAOC組的S—1株系丹參酚酸B最多比野生型對(duì)照發(fā)根提高了78％，干重含量從10．73mg/g提高到19．07mg/g。轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根中其他活性物質(zhì)(丹參酮Ⅰ和二氫丹參酮)以及迷迭香酸合成途

7、徑的中間體的含量也有不同程度的提高。同時(shí)RT—QPCR技術(shù)檢測(cè)了MeJA、迷迭香酸及萜類合成途徑上基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因發(fā)根中的這些合成途徑上的相關(guān)基因均有相應(yīng)地上調(diào)。
　　 本研究從多種轉(zhuǎn)基因事件證明了，MeJA生物合成途徑的基因操作可以同時(shí)對(duì)多個(gè)酶促反應(yīng)或者多條代謝途徑進(jìn)行全局調(diào)控，從而提高植物體內(nèi)多種次生代謝產(chǎn)物的含量，并且過(guò)量表達(dá)異源和內(nèi)源基因能夠產(chǎn)生同樣的效果。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的次生代謝產(chǎn)物含量的提高是穩(wěn)定且