雞C3d-P29分子佐劑作用效果的研究.pdf

1、基因疫苗主要由真核表達(dá)載體和保護(hù)性抗原基因構(gòu)成，此種疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有設(shè)計靈活、安全性高、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫等優(yōu)點。然而核酸疫苗存在的問題是產(chǎn)生抗體慢且水平低，需要加入有效的佐劑才能克服這些缺陷。 補體C3是機體補體激活的經(jīng)典途徑、替代途徑以及甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑的交匯點的中心成分，是宿主防御機能的一個分子。C3d片段是補體C3的裂解片段之一，是C3分子α鏈不能被蛋白酶再裂解并仍保持與

2、抗原共價連接的最小片段，具有廣泛的免疫學(xué)功能。其可以直接與抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的CR2受體結(jié)合，從而降低淋巴細(xì)胞的活化閾，提高抗原分子的免疫原性。因此C3d被認(rèn)為是基因疫苗的有效的分子佐劑。 新城疫病毒DNA疫苗是以新城疫病毒的F基因和HN基因為主要抗原基因的核酸疫苗。F蛋白即融合蛋白，是NDV一種較大的糖蛋白，是NDV感染細(xì)胞所必需的，是構(gòu)成NDV致病力的重要成分。以F基因為免疫原研制基因疫苗是進(jìn)行NDV分子免疫學(xué)防治的基

3、本策略。 本研究以雞補體C3d的受體結(jié)合功能區(qū)P29作為分子佐劑與新城疫病毒的F基因連接，構(gòu)建了NDVF基因-C3d-p29分子佐劑疫苗，并對其免疫效果進(jìn)行了初步研究。主要研究內(nèi)容如下： 試驗一、從肉雞補體C3dcDNA的克隆AA肉雞肝臟經(jīng)大腸桿菌活化后，液氮研磨法提取肝細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank發(fā)表序列，利用Primer5軟件設(shè)計一對引物，RT-PCR擴增C3d基因的cDNA。RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后克隆

4、到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切鑒定后測序，根據(jù)測序結(jié)果推導(dǎo)氨基酸序列。結(jié)果表明AA肉雞C3d基因與萊杭雞的同源性為99.5％，證明得到了AA肉雞C3d基因。比較雞與其他動物及人的CR2結(jié)合區(qū)，發(fā)現(xiàn)為雞與哺乳動物的同源性低，不足40％，而哺乳動物之間的同源性近80％。這表明CR2結(jié)合區(qū)具有種屬的特異性。 試驗二、新城疫病毒C3d-P29分子佐劑F基因疫苗的構(gòu)建C3d是補體C3的裂解產(chǎn)物之一，與抗原相連時可以明顯提高抗原分

5、子的免疫原性。CR2/CD21在其功能發(fā)揮過程中起到重要作用，P29為編碼C3d與CR2結(jié)合區(qū)域的基因。在克隆出C3dcDNA基礎(chǔ)上，設(shè)計引物克隆P29至pUC19載體，利用同裂酶.BamHⅠ和BglⅡ構(gòu)建pUC-P29.n。酶切獲得P29.n，將其克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)。最后RT-PCR擴增新城疫F基因，定向克隆至真核表達(dá)載體pCDNA-P29.n中P29.n的上游，構(gòu)建完成新城疫F基因疫苗。 對3周齡SPF