bFGF轉(zhuǎn)基因治療放射性腦損傷的實驗研究.pdf

1、第1章 bFGF基因擴增及真核表達載體pcDNA3.1(+)-bVGV 的構(gòu)建研究。 目的：用PCR法從現(xiàn)有pDONR-bFGF質(zhì)粒中擴增bFGF基因序列，構(gòu)建重組pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒并大量制備，為下一步在離體和活體實驗研究bFGF對RIB的保護作用奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)bFGF的DNA序列設(shè)計并合成特異性引物，并在其上下游引入EcoRI和NotI兩個酶切位點及保護堿基，Taq酶作用下采用PCR法擴增bF

2、GF基因片段，并與線性化后的pcDNA3.1(+)在連接酶作用下進行重組。雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)染感受態(tài)DH5a大腸桿菌，鑒定后大量制備。 結(jié)果： 1.bFGF基因片段擴增：從pDONR-bFGF經(jīng)PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到465bp左右的的特異性條帶。 2. 重組的pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒，經(jīng)EcoR Ⅰ、NotⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到兩個大小分別為465bp和5.4kb的片斷。

3、 第2章放射線誘導(dǎo)的C17.2神經(jīng)干細胞損傷及bFGF基因轉(zhuǎn)染后的保護作用研究。 目的：建立離體C17.2 NSC損傷模型，以pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSC為基因修飾手段，研究其放射耐受性，觀察bFGF轉(zhuǎn)基因治療放射性神經(jīng)細胞損傷的作用。 方法：采用nestin免疫細胞化學(xué)鑒定C17.2 NSC。將pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染C17.2 NSC，采用原位雜交、免疫細胞化學(xué)和We

4、stern blot法檢測bFGF在C17.2 NSC的表達。流式細胞儀觀察放射后早期凋亡，Hoechst33258觀察凋亡形態(tài)，MTT法測細胞活性并擬合生存曲線，研究bFGF在離體細胞水平對放射性損傷的保護作用。 結(jié)果: 1.NSC的培養(yǎng)和鑒定：免疫細胞化學(xué)染色顯示95﹪NSC呈Nestin陽性染色。 2.bFGF基因在C17.2 NSC的表達重組bFGF轉(zhuǎn)染C17.2 NSC后24h，免疫組化與原位雜交顯示在

5、C17.2 NSC胞漿中有bFGFmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。Western Blot可檢測到轉(zhuǎn)染的C17.2 NSC中有bFGF蛋白，而未轉(zhuǎn)bFGF的C17.2 NSC中無bFGF蛋白存在。 3.C17.2 NSC照射后凋亡及bFGF的作用經(jīng)Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察到未經(jīng)放射處理的C17.2 NSC中未見凋亡現(xiàn)象，經(jīng)放射處理后C17.2 NSC有大量的凋亡細胞，并可見少量凋亡小體，而轉(zhuǎn)染重組pcDNA-bFGF

6、的C17.2 NSC中凋亡細胞少。 流式細胞儀分析結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組在2Gy和6Gy劑量放射后，凋亡率和死亡率相近，均較未照射組高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒后，C17.2 NSC在2Gy和6Gy劑量放射后凋亡率和死亡率均低于前兩組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒組在8Gy照射后仍可存活，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組照

7、射8Gy后大片死亡。 4.NSC放射后生存曲線對照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組兩組生存分數(shù)沒有差異，合并為C17.2組按一組計算，轉(zhuǎn)染bFGF組單獨計算；兩條生存曲線中實測值與方程預(yù)計值的相關(guān)性均為r=0.96。C17.2組α/β值為0.159/0.038Gy，bFGF組為0.09/0.088Gy，C17.2組DO為0.98Gy，bFGF組為2.03Gy，SF2值，C17.2組為0.58，bFGF組為0.64。 重組的bFGF可轉(zhuǎn)染

8、C17.2 NSC，重組bFGF轉(zhuǎn)染的NSC穩(wěn)定表達bFGF。bFGF可增強C17.2 NSC的放射抵抗力，對輻射引起的NSC損傷具有保護作用。 第3章 RIB大鼠模型建立和放射后行為學(xué)、組織病理學(xué)、BBB通透性的定量分析研究. 目的:建立RIB大鼠模型。觀察不同放射劑量條件下RIB鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降情況，了解組織病理學(xué)特點、突觸超微結(jié)構(gòu)改變情況，并定量分析BBB通透性改變。 方法:對各組實驗大鼠采用直線加速器給

9、以不同放射劑量的照射，然后利用Morris水迷宮為工具，檢測RIB鼠在不同放射劑量下學(xué)習(xí)記憶能力。組織病理學(xué)HE染色觀察各組病理變化特點，透射電鏡觀察海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化。干一濕重法和伊文氏蘭法檢測放射后BBB通透性。 結(jié)果: 1、SD大鼠放射性腦損傷模型制備采用直線加速器給以不同放射劑量照射，與臨床RIB發(fā)生的病理生理狀態(tài)接近，各組大鼠照射后生存生長良好，無癱瘓、抽搐及異常神經(jīng)反射出現(xiàn)。 2、RIB模型鼠水迷宮

10、實驗檢測學(xué)習(xí)、記憶能力5組大鼠照射前平均尋臺潛伏期、路徑長度和搜索策略均沒有差異(P>0.05)；分別給以假放射對照、10Gy、20Gy、30ay和40Gy不同劑量照射后，組間比較5組平均尋臺潛伏期間存在差異(P<0.05)；組內(nèi)比較20Gy、30 Gy和40Gy比對照組和10 Gy組平均潛伏期長(P<0.05)。放射后7d、20d、60d不同時間點之間沒有差異(P>0.05)。各組大鼠4個時間點總路徑長度，隨著放射劑量的增加而逐步增加

11、(P<0.05)；各組大鼠在不同時間點，目標(biāo)象限路徑長度與總路徑長度的百分比，隨著放射劑量增大而縮短(P<0.05)表明放射線照射對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有影響，并且與放射劑量正相關(guān)。 3、HE染色情況對照組、10Gy和20Gy照射組放射后1W未見明顯病理變化；30Gy和40Gy組可見海馬和皮層神經(jīng)元輕度變性，胞核染色質(zhì)濃集，胞體萎縮，胞漿紅染，細胞有空泡變性現(xiàn)象發(fā)生。白質(zhì)區(qū)域較對照組呈現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)梳松、腦組織內(nèi)血管擴張和血管周隙擴大等

12、表現(xiàn)；40Gy組較30Gy組上述病變稍重。 4、海馬突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)的測量照射組大鼠比對照組突觸活性帶長度短，突觸界面曲率小，突觸間隙寬度變窄，PSD厚度變薄，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；除PSD厚度外其它指標(biāo)30Gy照射組與20Gy照射組之間也存在不同(P<0.05)。表明放射可造成突觸結(jié)構(gòu)破壞，且與劑量正相關(guān)。 5、干－濕重法和伊文氏藍法定量檢測血腦屏障通透性干－濕重法檢測腦組織含水量放射后比放射前增加(P<0.

13、05)，放射后2d、7d、20d和60d各組腦含水量沒有差異(P>0.05)；伊文氏藍法檢測，放射后EB含量比放射前高(P<0.05)，放射后2d、7d、20d和60d各組間EB含量也有差異(P<0.05)，表明EB法在測定RIB模型鼠BBB通透性上，較干－濕重法更為敏感。 第4章側(cè)腦室注射pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒對RIB模型鼠的保護作用研究。 目的：觀察側(cè)腦室注射重組pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)粒對R

14、IB的保護作用，了解bFGF轉(zhuǎn)基因治療后模型鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞的變化和GFAP的表達情況及Vimcntin－mRNA的水平，并探討在對RIB模型鼠的保護中的作用。 方法：對RIB模型鼠分組后分別側(cè)腦室注射pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒，并設(shè)生理鹽水對照組，觀察注射后模型鼠腦組織病理學(xué)情況、學(xué)習(xí)記憶能力和BBB通透性的變化，同時免疫組化法觀察星形膠質(zhì)細胞數(shù)量的變化和GFAP表達的強度，RT-PCR法

15、測Vimentin-mRNA表達水平。 結(jié)果： 1、行為學(xué)檢測情況Morris水迷宮測驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-bFG組模型鼠平均尋臺潛伏期明顯短于注射pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組和注射NS組，路徑總長度也短于注射空質(zhì)粒組和注射NS組(P<0.05)。 2、質(zhì)粒注射后海馬突觸TPSD結(jié)果突觸超微結(jié)構(gòu)觀察表明，注射pcDNA3.1(+)-bFGF組TPSD大于其它三組(P<0.05)。 3、

16、質(zhì)粒注射后BBB通透性定量檢定各組大鼠EB法檢測BBB通透性結(jié)果顯示：注射后20d測得pcDNA3.1(+)-bFGF組腦組織EB含量為34.57±7.3μg/g，空質(zhì)粒組為75.8±9.4 μg/g，NS組為72.6±8.7 μg/g，注射pcDNA3.1(+)一bFGF組腦組織EB含量低于其它兩組(P<0.05)。 4、免疫組化檢測GFAP陽性細胞的表達和HE染色情況注射質(zhì)粒20d后GFAP的表達以注射pcDNA3.1(+)

17、-bFGF組為最多，注射空質(zhì)粒和NS組相似，對照組最少，差異均有統(tǒng)計意義(P<0.05)。60d后再次檢測RIB模型鼠bFGF治療組，GFAP陽性細胞數(shù)多于對照組，但較20d時為少(P<0.05)；GFAP表達陽性灰度20d時放射后各組均比對照組高(P<0.05)，以注射pcDNA3.1(+)-bFGF組最為明顯(P<0.01)；60d時結(jié)果相似。HE染色可見pcDNA3.1(+)-bFGF組上述放射后組織病理學(xué)改變減輕。 5、

18、RT-PCR法檢測vimentin-mRNA表達各組vimentin-mRNA的RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳后對比分析，20d時注射空質(zhì)粒組和NS組結(jié)果相似，為4組中最高，注射pcDNA3.1(+)-bFGF組高于對照組(P<0.05)。提示放射可以引起vimentin-mRNA表達增高，注射pcDNA3.1(+)-bFGF質(zhì)?？梢詮霓D(zhuǎn)錄水平降低vimentin-mRNA的產(chǎn)生，60d時各組vimentin-mRNA沒有差異(P>0.05)