紅花水提物的抗氧化作用及ESR波譜研究.pdf

1、氧化-抗氧化平衡是機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本內(nèi)涵之一,生物體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等,這些抗氧化物質(zhì)不斷清除產(chǎn)生過多的氧自由基,以保持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡；一旦氧自由基產(chǎn)生超過清除,一些重要的酶的功能就會被破壞,出現(xiàn)氧化應激,引起細胞膜多價不飽和脂肪過氧化反應。因自由基氧化應激而損傷生物分子包括蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過氧化等,涉及人類一些疾病的病因?qū)W及病理過程,神

2、經(jīng)系統(tǒng),早老性癡呆癥,震顫麻痹癥,癲癇等疾病都有氧自由基的參與；在循環(huán)系統(tǒng),動脈粥樣硬化,血栓的形成,心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病過程中氧自由基也起著重要作用；肝炎和糖尿病與氧自由基密切相關(guān)；致癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的產(chǎn)生與參與；白內(nèi)障的形成和視網(wǎng)膜的損傷是氧自由基和脂質(zhì)過氧化的直接結(jié)果；在免疫反應的炎癥中,巨噬細胞呼吸爆發(fā)釋放大量氧自由基等。其中典型的例子是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)氧化修飾導致的AS發(fā)生發(fā)展。ox-

3、LDL能夠誘發(fā)氧自由基的產(chǎn)生,生成脂過氧自由基,引發(fā)脂質(zhì)過氧化的連鎖反應,進而損傷內(nèi)皮細胞的屏障功能,使其通透性增高,加速AS的形成；心肌缺血再灌注損傷近年來受到人們廣泛的關(guān)注,其氧自由基產(chǎn)生過多是其發(fā)生機制之一；過氧化氫(H2O2)是機體氧化代謝產(chǎn)物,同時又是一種活性氧,很容易穿透細胞膜到達胞內(nèi)位點,生成·OH等活性更強的自由基,引起一系列的損傷,采用過氧化氫損傷模型可模擬多種氧自由基引發(fā)疾病的病理狀態(tài)。
　　 氧自由基損傷與

4、人類的100多種疾病有直接關(guān)系,因此,預防或減少體內(nèi)的氧自由基損傷,從而減少疾病的發(fā)生是人們一直期待解決的問題。本研究作為科技部國際合作項目(十一五科技計劃):抗氧化中藥功效及安全性評價技術(shù)體系的建立的子課題,通過文獻查閱及前期的實驗研究發(fā)現(xiàn),紅花作為活血化瘀的常用中藥,具有多方面的藥理作用,在防治心血管疾病方面具有明顯的優(yōu)勢。因此,本項研究從體內(nèi)和體外兩個層次,以抗氧化為切入點,采用不同的氧化病理損傷模型,觀察紅花水提物抗氧化作用及其

5、機制,為紅花的臨床應用提供科學依據(jù)。
　　 本研究采用整體大鼠高脂血癥模型、體外ox-LDL致心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷模型、心肌微血管內(nèi)皮細胞缺氧再給氧損傷模型、乳鼠心肌細胞缺氧再給氧損傷模型、乳鼠心肌細胞H2O2損傷模型,觀察紅花水提物的抗氧化作用和作用機制,實驗結(jié)果如下:
　　 1.紅花水提物對高脂血癥大鼠抗氧化作用的影響
　　 喂飼高脂飼料建立高脂血癥大鼠模型,觀察紅花水提物對高脂血癥大鼠的保護作用。實驗共分

6、5組:空白對照組,模型對照組,紅花水提物組(4.05,2.03,0.81 g生藥·kg-1)劑量組,連續(xù)給藥4周后,測定血清MDA,SOD和NO水平。實驗結(jié)果表明:給予紅花水提物三個劑量后可明顯降低高脂血癥大鼠血清MDA的含量,中劑量能提高血清SOD活性,提示紅花水提物對高脂血癥大鼠具有一定程度的抗氧化作用。
　　 2.紅花水提物對ox-LDI所致心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷的影響
　　 采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞,

7、觀察紅花水提物預處理對ox-LDL誘導損傷的心肌微血管內(nèi)皮細胞的保護作用。實驗分5組,空白對照組:正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對照組:加入ox-LDL(100μg·mL-1)孵育24 h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別加入不同濃度的紅花水提物預處理24 h,然后換為100μg·mL-1的ox-LDL溶液孵育24 h。所有細胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗結(jié)束后分別收集

8、細胞上清液測定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細胞懸液應用電子自旋波譜儀測定活性氧自由基信號。實驗結(jié)果表明:紅花水提物預處理能明顯提高ox-LDL損傷的內(nèi)皮細胞存活率,減少LDH,MDA和XOD釋放量,提高SOD,GSH-Px和NOS活性,同時使細胞懸液中的自由基信號明顯減弱。結(jié)果提示紅花水提物對ox-LDL損傷的心臟微血管內(nèi)皮細胞具有保護作用,其機制可能與直接減少自由基生成,增強其清除以及增強內(nèi)源性

9、抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 3.紅花水提物對心肌微血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞缺氧/復氧所致?lián)p傷的影響
　　 分別采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞和原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞,建立細胞缺氧/復氧模型,觀察紅花水提物預處理對血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用。實驗各分5組,空白對照組:正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對照組:缺氧3h/復氧1h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別給予不同濃度的紅花水提物預

10、處理24h后,缺氧3h/復氧1h。除缺氧外,所有細胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗結(jié)束后分別收集細胞上清液測定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細胞懸液應用電子自旋波譜儀測定活性氧自由基信號。實驗結(jié)果表明:紅花水提物預處理能明顯提高缺氧3h/復氧1h后細胞存活率,減少LDH,MDA釋放,降低XOD活力,提高SOD,NO和NOS活性,同時使細胞懸液中的活性氧

11、自由基信號明顯減弱。結(jié)果提示紅花水提物對心臟微血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用,其機制可能與直接減少自由基生成,增強其清除以及增強內(nèi)源性抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 4.紅花水提物對體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞H2O2所致氧化損傷的影響
　　 采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞,建立心肌細胞H2O2氧化損傷模型,觀察紅花水提物預處理對心肌細胞H2O2氧化損傷的保護作用。實驗分5組,空白對照組:正常普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對照組

12、:換為H2O2(1 mmol·L-1)孵育1h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別給予不同濃度的紅花水提物,預處理24h,然后換為H2O2(1mmol·L-1)孵育1h。所有細胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗結(jié)束后分別收集細胞上清液測定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細胞懸液應用電子自旋波譜儀測定活性氧自由基信號。實驗結(jié)果表明:紅花

13、水提物三個劑量組預處理能明顯提高H2O2氧化損傷的心肌細胞存活率,減少LDH,MDA和XOD含量,提高SOD,GSH-Px和NO活性,同時有使細胞懸液中的自由基信號減弱的趨勢。結(jié)果提示紅花水提物對心肌細胞H2O2氧化損傷具有保護作用,其機制可能與直接減少自由基生成,增強其清除以及增強內(nèi)源性抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 綜上,紅花水提物預處理不僅在整體動物模型,對高脂血癥大鼠具有一定的抗氧化作用,在體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細胞ox-LD