NDRG2(371)相互作用分子篩選.pdf

1、NDRG基因家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一族基因。該家族有4個成員：NDRG1-4。其中，NDRG2基因編碼371個氨基酸和357個氨基酸兩個亞型，二者差別在于N-端的14個氨基酸：EAELAARILLDQGQ。NDRG2（357）是我們課題組首先發(fā)現(xiàn)的一個在腫瘤組織和細胞中低表達的新基因。
　　關于這個家族的初步研究表明：該家族參與了細胞分化，個體器官的發(fā)育及應激反應，并具有抑制腫瘤的增殖與轉移的功能。我們對于NDRG2（357）功能的

2、研究表明：NDRG2（357）mRNA的水平高低與細胞的增殖能力呈負相關。過表達NDRG2（357）可抑制膠質瘤細胞增殖。但到目前為止，對于NDRG家族到底如何在細胞中發(fā)揮作用仍然不十分清楚。我們利用生物信息學的方法對其基因結構及其編碼蛋白也進行了多項分析，未現(xiàn)任何功能結構域。
　　對于功能未知的新基因，尋找與之相互作用分子是研究其功能的重要策略。為進一步研究NDRG2的功能，前期我們課題組的張璟博士以NDRG2（357）為誘餌，

3、利用酵母雙雜交方法篩選成人腦cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)MSP58（58-KDamicrospheruleprotein）能夠與NDRG2（357）發(fā)生相互作用，并在體外和體內(nèi)進行了驗證。在本部分實驗中，我們以NDRG2（371）為誘餌，利用酵母雙雜交方法篩選胎腦cDNA文庫，尋找與之相互作用的分子。最終得到12個具有正確讀框的克隆。經(jīng)blast核苷酸相似性分析，12個克隆代表了9中基因。隨后，我們在酵母中再次驗證了NDRG2（371）與12個陽

4、性克隆的相互作用。同時，利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)在HEK293細胞中進一步驗證這一相互作用。在這9個基因中，我們重點對Na+/K+ATPaseβ1與NDRG2（371）的相互作用進行研究。同時構建了兩個分子的截短體，通過共轉酵母，確定了NDRG2（371）141-272aa是相互作用所必需的，β1的244-304aa是發(fā)揮相互作用必需的。最后通過免疫共沉淀證明了NDRG2（371）和β1在細胞內(nèi)也存在相互作用。
　　酵母雙雜交技術適

5、合研究兩個蛋白直接、瞬時相互作用，但是相互作用并不只是存在于兩個分子之間。蛋白在執(zhí)行功能時可能是以復合物的形式存在。TAP（Tandemaffinitypurification）方法與質譜技術聯(lián)用更適于研究相互作用的蛋白復合物，因為這種方法不但可使得相互作用的蛋白質以復合物的形式被純化出來，還可使這些蛋白復合物的組份、定位及轉錄后修飾保持在自然狀態(tài)下。因此，這兩種方法在研究蛋白質相互作用方面是理想的補充。為研究NDRG基因家族的相互作用

6、分子，我們包裝了所有NDRG家族成員C末端融合表達TAP標簽的腺病毒載體，建立了特異的用于尋找NDRG家族成員相互作用分子的哺乳動物細胞TAP系統(tǒng)。
　　綜上所述，本研究首次用酵母雙雜交的方法篩選并獲得了12個與NDRG2（371）具有相互作用的分子，并對其中的Na+/K+ATPaseβ1進行了深入研究，證實了兩個分子之間的物理相互作用及其相互作用部位。其次，為了補充酵母雙雜交的結果，我們建立了特異的用于尋找NDRG家族成員相互作