非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的一種急性、烈性、高度接觸性傳染性疾病。其臨床特征主要為全身出血、呼吸障礙和神經癥狀，發(fā)病率和死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大。且目前尚無有效的疫苗用于該病的預防，主要通過檢疫后撲殺來控制其爆發(fā)和流行。因此，建立科學有效的檢測診斷方法對于非洲豬瘟的防范具有重要意義。
　　為獲得ASFV P7

2、2融合蛋白，本研究利用前期研究中構建的重組菌株pET-30a-P72(BL21)接種到LB液體培養(yǎng)基，以IPTG進行誘導后，收集菌體并以超聲波進行裂解，裂解物經SDS-PAGE分析，證明了該P72融合蛋白可以在大腸桿菌BL21中大量表達。通過免疫印記技術分析可知，該融合蛋白可以與鼠抗His標簽單抗特異性反應，將表達的P72重組蛋白經His標簽蛋白純化試劑盒純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。復蘇本實驗室保存的抗ASFV的雜交瘤細胞株2

3、D3，擴大培養(yǎng)后接種于10周齡以上經產BALB/c小鼠，采用體內腹水誘生法制備了含有抗ASFV單抗的腹水。
　　將收集的ASFV抗體分別經飽和硫酸銨法、辛酸—硫酸銨聯(lián)合沉淀法、protein G柱親和層析法進行純化，對純化后的抗體經SDS-PAGE比較分析，最終選擇純化效果較好的protein G柱親和層析法。純化后的抗體經紫外分光光度儀測定濃度，并用已建立的間接ELISA法測定其效價，單抗為1∶160000，多抗為1∶51200

4、。
　　為制備ASFV膠體金免疫層析試紙條，研究中采用直徑為30nm的膠體金顆粒標記純化后的單抗2D3作為金標抗體，以純化后的多抗固定于NC膜上作為檢測線，其最佳濃度為1.47mg/mL;將葡萄球菌A蛋白(SPA)固定于NC膜上作為質控線，其最佳濃度為1.0mg/mL，組裝成用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條。以pET-30a和PGEX-6P-1為載體表達的ASFV P72蛋白（簡稱P3P蛋白和PXP蛋白）作為陽性樣品，PBS