串聯(lián)表達蛋白A-G-L Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其在口蹄疫鑒別診斷中的應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA，SPA)、鏈球菌（C和G群）蛋白G(Streptococcal protein G，SPG)和大消化鏈球菌蛋白L(Peptostreptococcus protein L，PPL)是典型的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。它們能結(jié)合大多數(shù)哺乳動物的免疫球蛋白，但結(jié)合方式和結(jié)合譜不同。三種蛋白可以優(yōu)勢互補，不僅有更好的結(jié)合能力，還具有更廣的結(jié)合譜，有很好的應(yīng)用前景。
　　本研究

2、選取PPL B3結(jié)構(gòu)域進行基因優(yōu)化，與現(xiàn)有的AG串聯(lián)基因形成不同拷貝數(shù)的AGL基因，連接到pET-30a(+)原核表達載體中，構(gòu)建pET-30a(+)-L、pET-30a(+)-AGL、pET-30a(+)-[AGL]2、 pET-30a(+)-[AGL]3四種重組表達載體。經(jīng)原核表達系統(tǒng)得到4種重組蛋白即L、AGL、[AGL]2、[AGL]3，均為可溶性表達。經(jīng)Ni-NTA親和層析純化得到的四種蛋白L、AGL、[AGL]2、[AGL]

3、3，其中[AGL]2重組蛋白表達量高而且純化回收率高。Western blot分析鑒定AGL、[AGL]2、[AGL]3蛋白均能與牛血清發(fā)生特異性反應(yīng)。Westernblot和間接ELISA分析結(jié)果顯示[AGL]2重組蛋白與可與9種哺乳動物Ig反應(yīng)，而且結(jié)合能力強于[AG]3重組蛋白。
　　對[AGL]2重組蛋白進行HRP標(biāo)記（過碘酸鈉法），經(jīng)直接ELISA方法測定[AGL]2-HRP有很高的結(jié)合兔IgG活性。Dot-ELISA和

4、間接ELISA結(jié)果顯示[AGL]2酶標(biāo)蛋白可結(jié)合9種哺乳動物Ig，而且[AGL]2酶標(biāo)蛋白結(jié)合人IgM和人IgA能力強于[AG]4酶標(biāo)蛋白。經(jīng)驗證，[AGL]2酶標(biāo)蛋白可檢測兔源免疫抗體;特異性檢測牛、犬、鹿、豬、羊血清中的布魯氏菌病抗體;特異性檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體。隨后，以本實驗室建立的8BF-ELISA檢測FMDV方法為基礎(chǔ)，優(yōu)化各個反應(yīng)條件，最終建立了可檢測牛、豬、羊、鹿的口蹄疫AGL-ELISA方法。應(yīng)用AGL-