顆粒裂解肽G13結構域在大腸桿菌中的高效融合表達.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptide)是生物體內產生的一種陽離子小分子多肽,廣泛存在于植物和動物體內,是天然免疫防御系統(tǒng)的一部分。當前,抗生素的大量使用導致耐藥性菌株的產生,因而開發(fā)新型抗生素顯得越來越重要。抗菌肽是通過物理作用造成細胞膜的穿孔而達到廣譜抗菌的效果,所以不容易導致耐藥性菌株的產生和交叉抗性反應,被認為是抗生素的替代品和增效劑,其潛在的價值已經受到人們的廣泛關注。
　　顆粒裂解肽(Granulysin)

2、是細胞毒性淋巴細胞CTL和天然殺傷細胞NK內的顆粒中含有的一種陽離子抗菌肽,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、寄生蟲均有殺菌活力,尤其是對結核分枝桿菌有直接的細胞毒性。G13結構域是顆粒裂解肽中含有一個a螺旋和loop結構的肽段,由19個氨基酸殘基組成。G13肽段可抑制細菌、真菌的活性,但對動物細胞和脂質體沒有影響,因此具有重要的研究和應用價值。
　　本研究采用兩種策略研究G13結構域在大腸桿菌中的表達。一種策略是用共轉化來抑制

3、抗菌肽的毒性。其步驟是以空質粒pThioHisA為模板,設計合成相應的特異性引物,通過PCR技術突變pThioHisA的堿基,PCR產物經磷酸化酶和DNA連接酶處理后,轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,篩選出陽性克隆,序列分析表明已成功將pThioHisA的AAG突變?yōu)門AG,將重組質粒pET28a-G13與pThioHisA突變體進行共轉化,篩選出陽性克隆并提取質粒,酶切結果顯示兩個質粒成功轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,I

4、PTG誘導共表達菌株后pThioHisA突變體的陰離子蛋白得到表達,但沒有獲得G13肽段。
　　另一種策略是利用融合表達的方法來抑制抗菌肽的毒性,從而提高抗菌肽在大腸桿菌中的表達量。其步驟是根據已報道的G13結構域氨基酸序列以及大腸桿菌密碼子的偏好性化學合成了G13結構域對應的編碼區(qū)的有意義鏈。以合成的序列為模板、用相應的特異性引物PCR擴增G13結構域編碼區(qū),將PCR產物與空載體pThioHisA用Eco R I、Sal I限制

5、性內切酶進行酶切后用DNA連接酶連接。將重組過的表達載體轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞,篩選出陽性克隆,序列分析表明目的基因已克隆到pThioHisA載體中,加入IPTG誘導目的蛋白的表達,表達產物經SDS-PAGE分析,在約16kD的位置有目的條帶,而對照菌無此特異性條帶,經凝膠分析軟件BandScan灰度掃描分析目的蛋白占總蛋白的58％,目的蛋白以包涵體形式存在,包涵體蛋白經8 mol/L尿素溶解后,再經CNBr切割,CM-32陽離