顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的高效融合表達(dá).pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptide)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一種陽離子小分子多肽,廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi),是天然免疫防御系統(tǒng)的一部分。當(dāng)前,抗生素的大量使用導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生,因而開發(fā)新型抗生素顯得越來越重要?？咕氖峭ㄟ^物理作用造成細(xì)胞膜的穿孔而達(dá)到廣譜抗菌的效果,所以不容易導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生和交叉抗性反應(yīng),被認(rèn)為是抗生素的替代品和增效劑,其潛在的價(jià)值已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。
　　顆粒裂解肽(Granulysin)

2、是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL和天然殺傷細(xì)胞NK內(nèi)的顆粒中含有的一種陽離子抗菌肽,對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、寄生蟲均有殺菌活力,尤其是對(duì)結(jié)核分枝桿菌有直接的細(xì)胞毒性。G13結(jié)構(gòu)域是顆粒裂解肽中含有一個(gè)a螺旋和loop結(jié)構(gòu)的肽段,由19個(gè)氨基酸殘基組成。G13肽段可抑制細(xì)菌、真菌的活性,但對(duì)動(dòng)物細(xì)胞和脂質(zhì)體沒有影響,因此具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究采用兩種策略研究G13結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達(dá)。一種策略是用共轉(zhuǎn)化來抑制

3、抗菌肽的毒性。其步驟是以空質(zhì)粒pThioHisA為模板,設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的特異性引物,通過PCR技術(shù)突變pThioHisA的堿基,PCR產(chǎn)物經(jīng)磷酸化酶和DNA連接酶處理后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽性克隆,序列分析表明已成功將pThioHisA的AAG突變?yōu)門AG,將重組質(zhì)粒pET28a-G13與pThioHisA突變體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化,篩選出陽性克隆并提取質(zhì)粒,酶切結(jié)果顯示兩個(gè)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,I

4、PTG誘導(dǎo)共表達(dá)菌株后pThioHisA突變體的陰離子蛋白得到表達(dá),但沒有獲得G13肽段。
　　另一種策略是利用融合表達(dá)的方法來抑制抗菌肽的毒性,從而提高抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)量。其步驟是根據(jù)已報(bào)道的G13結(jié)構(gòu)域氨基酸序列以及大腸桿菌密碼子的偏好性化學(xué)合成了G13結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼區(qū)的有意義鏈。以合成的序列為模板、用相應(yīng)的特異性引物PCR擴(kuò)增G13結(jié)構(gòu)域編碼區(qū),將PCR產(chǎn)物與空載體pThioHisA用Eco R I、Sal I限制

5、性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后用DNA連接酶連接。將重組過的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽性克隆,序列分析表明目的基因已克隆到pThioHisA載體中,加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,在約16kD的位置有目的條帶,而對(duì)照菌無此特異性條帶,經(jīng)凝膠分析軟件BandScan灰度掃描分析目的蛋白占總蛋白的58％,目的蛋白以包涵體形式存在,包涵體蛋白經(jīng)8 mol/L尿素溶解后,再經(jīng)CNBr切割,CM-32陽離