顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域的克隆及在大腸桿菌中的表達.pdf

1、顆粒裂解肽(Granulysin)是細胞毒性淋巴細胞CTL和天然殺傷細胞NK內(nèi)的顆粒中含有的一種多肽,天然顆粒裂解肽和重組顆粒裂解肽都具有廣譜抗菌活性。對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲等均具有殺傷活性,尤其是對分枝桿菌有直接的細胞毒性。
　　G13結(jié)構(gòu)域具有抑制細菌、真菌生長繁殖的活性,但對動物細胞和脂質(zhì)體沒有影響。目前藥物多肽主要通過化學方法合成和基因工程方法生產(chǎn)。由于化學方法合成多肽成本較高,所以本研究使 G13結(jié)構(gòu)

2、域在大腸桿菌中表達,得到有活性的重組顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域,從而為G13殺菌機理的研究和開發(fā)經(jīng)濟有效的生產(chǎn)方法奠定基礎。
　　本研究根據(jù)已報道的G13結(jié)構(gòu)域氨基酸序列以及大腸桿菌密碼子的偏好性化學合成了G13結(jié)構(gòu)域?qū)木幋a區(qū)的有意義鏈。以合成的序列為模板、用相應的特異性引物PCR擴增 G13結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)。將 PCR產(chǎn)物直接克隆到pBAD/TOPO ThioFusion表達載體上,經(jīng)過菌液PCR初步鑒定,篩選出陽性重組子,序列分析

3、表明目的基因已克隆到T載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,并在基因工程菌株培養(yǎng)過程中加入誘導劑阿拉伯糖,在誘導時間為0h、2h、4h和5h條件下收集適量菌液,檢測目的蛋白的表達。SDS-PAGE分析表明在約15kD處出現(xiàn)一特異性條帶,而對照菌沒有出現(xiàn)這條帶,但蛋白表達量很低。同時監(jiān)測了基因工程菌株在加入誘導劑前后OD600值的變化,發(fā)現(xiàn)隨著外源蛋白的表達,菌液OD600值下降,但隨后又緩慢上升,將上升后的菌液提取

4、質(zhì)粒后重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單克隆,測序發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的菌液中由于毒性蛋白表達帶來的選擇壓力,啟動子發(fā)生了下降突變。
　　將引物的兩端加入Eco R I、Sal I限制性內(nèi)切酶位點后,回收純化后的G13結(jié)構(gòu)域PCR產(chǎn)物,用Eco R I、Sal I限制性內(nèi)切酶進行酶切后連接到原核表達載體pThioHisA的相應酶切位點上。將重組過的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞,加入 IPTG誘導目的蛋白的表達,表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE