三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)珍珠培育及α-,2-巨球蛋白N末端保守域片斷的原核表達(dá).pdf

1、8mm以上、光澤度好的正圓珍珠在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)十分受關(guān)注，有核珍珠一般比無(wú)核珍珠的顆粒大。三角帆蚌有核珍珠常采用外套膜插核的方法；由于其外套膜比較薄，不適宜插植大核以培育大顆粒珍珠。然而，三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)區(qū)域空間很大，如果能在三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)內(nèi)插核培育有核珍珠，就有可能成功培育大顆粒珍珠，能為淡水有核珍珠培育開(kāi)辟一條新途徑。 近年來(lái)，河蚌疾病一直困擾著珍珠養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，預(yù)防河蚌疾病成了育珠生產(chǎn)的關(guān)鍵。對(duì)三角帆蚌的免疫因子的研究也已成為河

2、蚌疾病預(yù)防研究的熱點(diǎn)。 基于上述兩方面，本研究對(duì)三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)插核培育大顆粒珍珠進(jìn)行了探索，并對(duì)三角帆蚌免疫因子α2M基因N末端保守域片段的原核表達(dá)載體pET32a／α2M—N的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了初步研究。 1.三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)珍珠培育部位生物性狀的研究 用光鏡對(duì)三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)珍珠培育部位進(jìn)行組織學(xué)觀察和生化成分分析，結(jié)果顯示該部位組織結(jié)構(gòu)隨性腺發(fā)育期發(fā)生變化：性腺發(fā)育前期，性腺濾泡萎縮，濾泡間充填豐富的結(jié)締組

3、織和平滑肌纖維薄層肌肉組織：發(fā)育后期，性腺濾泡豐滿，濾泡間結(jié)締組織和平滑肌纖維減少。生化分析顯示鈣、蛋白、堿性磷酸酶、碳酸脫水酶在內(nèi)臟團(tuán)珍珠培育部位均有分布，但鈣的含量比常規(guī)外套膜插核的部位少；說(shuō)明內(nèi)臟團(tuán)具有珍珠生物礦化所需的生化條件，內(nèi)臟團(tuán)培育珍珠是可行的；但性腺發(fā)育狀況及鈣貯存的不足會(huì)影響內(nèi)臟團(tuán)內(nèi)珍珠的培育。 2.三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)有核珍珠培育技術(shù)的研究 采用組織塊貼片培養(yǎng)包裹珠核后插入三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)的方法進(jìn)行有核珍珠培

4、育，結(jié)果表明，外套膜組織細(xì)胞貼核生長(zhǎng)正常，插入內(nèi)臟團(tuán)后能夠形成珍珠囊，經(jīng)45天養(yǎng)殖后，可以看到在珠核外面已有珍珠層沉積。但內(nèi)臟團(tuán)插核后育珠蚌的死亡率為30—50％，吐核率高達(dá)20-30％，因此如何降低育珠蚌的死亡率和吐核率是今后進(jìn)一步研究的重要課題。 3.三角帆蚌α2巨球蛋白N末端保守域片斷的原核表達(dá) 以三角帆蚌血淋巴細(xì)胞提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增三角帆蚌α2M基因N末端保守域片段的特異性引物，通過(guò)RT—PCR方

5、法擴(kuò)增目的基因片段。將純化的RT—PCR產(chǎn)物采用酶切(Sac Ⅰ，Xhol)連接的方式，定向克隆至載體PET32 a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET32a／α2M—N，經(jīng)PCR驗(yàn)證和酶切反應(yīng)驗(yàn)證，及測(cè)序分析表明已成功地構(gòu)建了α2M基因N末端保守域片段的原核表達(dá)載體PET32a／α2M—N。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21，經(jīng)SDS—PAGE分析表明α2M—N融合蛋白能在菌株BL21內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)，能為α2巨球蛋白活性分析和生物學(xué)功能的研究奠定基礎(chǔ)。