肺炎支原體感染呼吸道上皮細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景和目的:
　　肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, MP）是引起各年齡段呼吸道感染的重要病原體之一。MP感染一般呈自限性過(guò)程，預(yù)后良好，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)重癥與難治性MP肺炎呈上升趨勢(shì)，部分患兒甚至出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，因此受到更加廣泛的關(guān)注。但MP感染的致病機(jī)制目前仍不完全明確，主要有呼吸道上皮細(xì)胞粘附、MP直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制等學(xué)說(shuō)。雖然MP粘附于呼吸道上皮細(xì)胞并與上皮細(xì)胞相互作用是MP發(fā)病早期中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)

2、，但對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞被MP感染后所發(fā)生的反應(yīng)知之甚少。目前已知呼吸道上皮細(xì)胞受MP刺激后具有釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng)的能力，但迄今為止所有研究都僅基于對(duì)個(gè)別已知蛋白的分析測(cè)定，缺乏整體性，并且無(wú)法對(duì)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。
　　基于上述背景，本研究擬從整體角度采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)MP感染后的呼吸道上皮細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離鑒定，比較正常狀態(tài)與受MP感染后分泌蛋白圖譜的差異，通過(guò)生物信息學(xué)手段分析并在功能上驗(yàn)證差異蛋白，尋找具

3、有生物學(xué)意義的上皮細(xì)胞分泌蛋白，為進(jìn)一步闡明MP感染的發(fā)病機(jī)制提供重要的理論依據(jù);同時(shí)尋找特異蛋白作為MP感染診斷/治療的分子指標(biāo)/靶點(diǎn)，為臨床診斷/治療提供新的線索。
　　方法:
　　1.以MP感染人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）作為體外研究的模型系統(tǒng)，通過(guò)MTT比色法、臺(tái)盼藍(lán)染色、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等方法確立合適的無(wú)血清培養(yǎng)條件。
　　2.利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合DeCyder MS無(wú)標(biāo)記定量軟件，分析比較MP感染（處

4、理組）與非感染（對(duì)照組）情況下，A549細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化。
　　3.綜合GO數(shù)據(jù)庫(kù)、分泌蛋白預(yù)測(cè)軟件(SingalP、SecretomeP)和ExoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定的所有蛋白進(jìn)行檢索分析，預(yù)測(cè)所有蛋白的細(xì)胞定位。
　　4.BiNGO軟件分析差異分泌蛋白的細(xì)胞組分、分子功能及其參與的生物學(xué)過(guò)程。
　　5.KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異分泌蛋白涉及的生物學(xué)通路。
　　6.STRING軟件分析差異分泌蛋白之間的

5、相互作用。
　　7.挑取6個(gè)差異分泌蛋白(ADAM9、SERPNE1、IL-33、IGFBP4、Gal-1、MIF)，采用Western blot和RT-PCR對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　8.設(shè)計(jì)Gal-1的siRNA序列，采用Western blot對(duì)其干擾效果進(jìn)行驗(yàn)證，挑取干擾效率良好的siRNA進(jìn)行進(jìn)一步Gal-1的功能研究。Gal-1的功能研究分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧(ROS)水平，免疫熒光觀察γH2AX形成情況

6、，Westernblot檢測(cè)γH2AX表達(dá)情況，以及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)改變。
　　9.采用配對(duì)對(duì)照研究的方式，收集MP肺炎患兒和無(wú)合并感染的異物吸入患兒的外周血和肺泡灌洗液，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)其中IL-33的水平。
　　結(jié)果:
　　1.無(wú)血清培養(yǎng)24 h時(shí)，A549細(xì)胞存活率均在98.5％以上，其細(xì)胞形態(tài)、增殖速率和存活率與含血清培養(yǎng)均無(wú)明顯差異。
　　2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)共鑒定256個(gè)非冗余

7、蛋白質(zhì)，其中對(duì)照組233個(gè)，處理組237個(gè)。經(jīng)DeCyder MS無(wú)標(biāo)記定量分析共發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異超過(guò)1.5倍(p＜0.05)的蛋白質(zhì)有113個(gè)，其中65個(gè)在處理組表達(dá)上調(diào)，48個(gè)在處理組表達(dá)下調(diào)。
　　3.SingalP和SecretomeP軟件預(yù)測(cè)顯示，在鑒定的256個(gè)蛋白中，83個(gè)屬于經(jīng)典途徑分泌的蛋白，69個(gè)屬于非經(jīng)典途徑分泌蛋白。同時(shí)，ExoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，在鑒定的256個(gè)蛋白中，190個(gè)蛋白能通過(guò)外泌小體到達(dá)胞外

8、。GO數(shù)據(jù)庫(kù)資源檢索發(fā)現(xiàn)鑒定的256個(gè)蛋白中的大部分蛋白對(duì)應(yīng)一種以上的細(xì)胞成分分類注釋，可同時(shí)涉及細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞胞漿等多種細(xì)胞組分。
　　4.BiNGO軟件分析顯示，細(xì)胞組分方面:113個(gè)差異分泌蛋白并不是來(lái)自某一特定的細(xì)胞器，而是來(lái)自多個(gè)不同的細(xì)胞器，比如線粒體、溶酶體等;分子功能方面:上調(diào)的65個(gè)蛋白主要與氧化還原活性、蛋白結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)功能有關(guān)，而下調(diào)的48個(gè)蛋白主要與酶活性抑制和水解酶活性有關(guān);生物學(xué)過(guò)程方面:上調(diào)

9、的蛋白主要涉及糖代謝、炎癥反應(yīng)、氧化還原和防御反應(yīng)這四個(gè)過(guò)程，而下調(diào)的蛋白主要涉及系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程。
　　5.KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索發(fā)現(xiàn)113個(gè)差異蛋白共涉及85條生物學(xué)通路，經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)其主要富集于丙酮酸代謝、糖酵解/糖原合成、病原體感染等11條通路。
　　6.STRING在線分析發(fā)現(xiàn)113個(gè)差異蛋白中，有88個(gè)蛋白可與其他蛋白存在相互作用。其中，上調(diào)的65個(gè)蛋白主要形成3個(gè)小的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分別為應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋

10、白網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)通路相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò);下調(diào)的48個(gè)蛋白，主要形成2個(gè)小的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分別為糖代謝相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)過(guò)程負(fù)性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)。
　　7.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示ADAM9、SERPNE1、IL-33、IGFBP4、Gal-1、MIF這6個(gè)蛋白的表達(dá)水平與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。
　　8.siRNA干擾Gal-1表達(dá)后，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低、細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦

11、點(diǎn)形成明顯減少、γH2AX表達(dá)水平亦降低，同時(shí)細(xì)胞因子IL-8和IL-18在24 h時(shí)表達(dá)水平明顯升高。
　　9.IL-33在MP肺炎患兒的血清和肺泡灌洗液中的水平顯著高于無(wú)感染的支氣管異物患兒。
　　結(jié)論:
　　1.MP感染可引起A549細(xì)胞分泌蛋白表達(dá)的改變;運(yùn)用非標(biāo)記定量鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析A549細(xì)胞在MP感染情況下的差異分泌蛋白質(zhì)組，是探求MP發(fā)病機(jī)制高效、可行的研究策略。
　　2.非經(jīng)典分泌途徑，