重組Dnmt1質粒對人結腸癌SW1116細胞基因表達和MSI的影響.pdf

1、目的:結腸癌在內的多種腫瘤發(fā)生過程中存在表觀遺傳調控的異常,即存在DNA甲基化/組蛋白乙酰化的紊亂.催化DNA甲基化過程的是DNA甲基轉移酶(Dnmt),按照酶的不同功能又分為從頭產生DNA甲基化的酶(Dnmt3a,Dnmt3b)和維持DNA甲基化的酶(Dnmtl).目前認為正確維持甲基化狀態(tài)是生長發(fā)育過程中所必需的,腫瘤的發(fā)生與甲基化狀態(tài)發(fā)生異常有關.該研究探討了含有Dnmtl基因的真核表達質粒對人結腸癌SWl116細胞腫瘤相關基因表

2、達的影響,并且分析了錯配修復基因甲基化對腫瘤細胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的影響,旨在從細胞分子水平探討DNA甲基化紊亂和結腸癌發(fā)生機制的關系.方法:培養(yǎng)結腸癌細胞系SWl116,將含有人的正義Dnmtl的真核表達載體pCMV-HMT,反義Dnmtl載體pCMV-THM及pCMV空質粒,利用脂質體轉染方法導入SWl116細胞,進行穩(wěn)定轉染.通過標記基因Neo篩選帶有外源基因的G418抗藥性克隆.分別提取轉染正、反義Dnmtl,空質粒和未經

3、轉染的SWl¨6細胞的DNA、RNA和總蛋白.以Western印跡實驗分析各組細胞Dnmtl蛋白的表達情況.定量PCR檢測各組細胞腫瘤相關基因[hMLHl、hMSH2、c-myc和p16<'INK4A>)的mRNA表達.甲基化特異性PCR分析細胞腫瘤相關基因啟動子區(qū)甲基化情況.銀染法研究其對SWl116細胞MSI的影響.討論:通過基因轉染的方法研究某個基因在細胞中的作用是目前分子生物學常用的技術手段,其中脂質體介導是目前最常用的轉染方法