殘緣璃眼蜱subolesin和半胱氨酸蛋白酶基因生物學(xué)功能初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、殘緣璃眼蜱作為專性吸血外寄生蟲,能夠傳播多種病原體(特別是環(huán)形泰勒蟲),對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對于蜱以及蜱傳病的防治方法主要以化學(xué)藥物治療為主,但由此引發(fā)的環(huán)境污染、蜱的抗藥性等問題越來越嚴(yán)重,因此免疫學(xué)防治方法逐漸被重視起來。免疫學(xué)方法重要的基礎(chǔ)是尋找合適的蜱的功能基因作為保護(hù)性抗原,為抗蜱及蜱傳病疫苗提供理論性基礎(chǔ)。根據(jù)已有的蜱種功能基因的研究表明,subolesin和半胱氨酸蛋白酶基因存在于多種生物體中;subolesi

2、n基因在高等真核生物中具有較高的同源性,在蜱種中具有較好的保守性:半胱氨酸蛋白酶(CP)與宿主血液消化及蜱的生長發(fā)育相關(guān)。
  試驗(yàn)首次從殘緣璃眼蜱、亞洲璃眼蜱中擴(kuò)增出subolesin基因ORF,大小均為492 bp,編碼163個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明,subolesin基因在各蜱種間具有高度保守性,且有一定的種間特異性和屬間差異性。將subolesin基因連接到pGEX-4T-1載體上進(jìn)行重組表達(dá),重組蛋白大小約為45 k

3、u。通過SDS-PAGE和Western blotting分析顯示,體外表達(dá)重組蛋白以包涵體形式存在,純化的目的蛋白與兔抗殘緣璃眼蜱饑餓成蜱血清、抗蜱唾液腺和抗蜱卵巢血清發(fā)生免疫反應(yīng)。實(shí)時熒光定量分析表明,subolesin基因存在于蜱的各個發(fā)育階段和組織,但相對表達(dá)豐度不同,中腸、唾液腺的表達(dá)豐度相對較高,在蜱吸血前后表達(dá)豐度有很大差異,成蜱吸血過程中subolesin基因表達(dá)豐度出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的現(xiàn)象;動物保護(hù)試驗(yàn)和RNAi試驗(yàn)證明

4、,蜱的吸血率、飽血體重、飽血時間、產(chǎn)卵率、卵的孵化率都受到影響;這些現(xiàn)象表明該基因可能與蜱的生長、發(fā)育及吸血相關(guān)。
  本試驗(yàn)利用通用引物cys500首次從殘緣璃眼蜱中獲得CP保守序列,通過5'RACE和3'RACE擴(kuò)增技術(shù)獲得CP基因全長。CP基因全長為1192 bp,包含一個999 bp的ORF。生物學(xué)軟件分析CP基因在不同蜱種間具有一定的保守性。連接到pET30a載體上成功表達(dá),重組蛋白約為45 ku;SDS-PAGE和We

5、stern blotting分析顯示,體外表達(dá)的融合蛋白以包涵體的形式存在,并和兔抗殘緣璃眼蜱饑餓成蜱血清發(fā)生免疫反應(yīng),表明該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。實(shí)時熒光定量分析顯示,CP基因表達(dá)具有選擇性,組織中僅中腸有較高的表達(dá)豐度,其他組織中相對表達(dá)豐度較低,基本可以忽略,蜱卵中該基因相對表達(dá)豐度較高,蜱吸血過程中基因表達(dá)豐度出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象;動物保護(hù)性試驗(yàn)和RNAi結(jié)果表明:蜱的吸血、飽血程度及產(chǎn)卵情況受到影響,證明CP可能與蜱的生長、發(fā)育

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