LSD1抑制劑TCP體外對腎癌786-O細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的:
　　初步研究賴氨酸特異性脫甲基酶1( LSD1)抑制劑反苯環(huán)丙胺對腎透明細胞癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并初步探討其機制。
　　方法:
　　1、細胞活力實驗:細胞培養(yǎng)成功后行 MTT實驗檢測不同濃度梯度下的反苯環(huán)丙胺(TCP)干預對數生長期的786-O細胞24h、48h和72h后的細胞生長抑制率,并設調零孔和對照組,計算50％致死濃度(IC50),然后繪制濃度-時間抑制率曲線圖;實驗重復3次。

2、
　　2、采用流式細胞儀(Annexin V/PI雙染法)分析、計算細胞凋亡率,并繪制曲線圖。
　　3、Trizol法提取實驗組和對照組細胞總RNA,應用分光光度計法檢測RNA濃度、純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,使用半定量RT-PCR檢測LSD1基因mRNA的表達量變化。
　　4、Western-blot檢測實驗組和對照組細胞LSD1蛋白表達量變化。
　　5、采用劃痕試驗觀察TCP對786-O細胞遷移力的

3、影響,拍照觀察12h、24h和48h細胞遷移距離。實驗重復3次。
　　6、Transwell細胞體外侵襲實驗檢測不同濃度梯度的 TCP作用對數生長期的786-O細胞24h侵襲到Tanswell小室下室面的數目,同時設立對照組,予以0.1%的結晶紫染色后拍照。實驗重復3次。
　　7、數據統(tǒng)計分析:所有數據以均數±標準差(x±s)表示,采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包的單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義;以P<0.01

4、為差異有顯著統(tǒng)計學意義;以P>0.05為差異無統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、不同濃度(0、10、20、40、80、160和320uM)的TCP作用于786-O細胞24h、48h和72h后,MTT法檢測結果顯示,1‰的DMSO溶液對786-O細胞無影響,TCP對786-O細胞的增殖有抑制作用,10uM以上隨藥物濃度的增大、作用時間的延長,抑制作用隨之增強,呈現明顯的時間-劑量效應關系(P<0.01)。計算出24h、48h和

5、72h TCP的IC50值分別為133.76uM、67.66uM和36.02uM。
　　2、流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測藥物誘導細胞凋亡分析表明, TCP作用腎癌786-O細胞48h,0uM組、DMSO組和10uM組兩兩比較,凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05),40uM-160uM組隨濃度的增高,早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加,與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時,細胞壞死率也同

6、步增高,說明TCP具有細胞毒性作用,隨藥物濃度增高,毒性隨之增大;
　　3、TCP處理786-O細胞48h后LSD1基因mRNA表達量的分析,40uM和80uM組的表達明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1基因mRNA表達量(P<0.01);0uM組與1‰DMSO組比較,結果無明顯差異(P>0.05);
　　4、Western-blot分析TCP處理細胞48h后LSD1蛋白在786-O細胞中的表達情況,40uM和80uM組

7、的表達明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1蛋白表達量(P<0.01);1‰DMSO組與0uM組比較,結果無明顯差異(P>0.05);
　　5、采用劃痕試驗觀察TCP對786-O細胞遷移力的影響,結果顯示:0uM組24h及48h愈合率分別為35.14%±3.91%、59.46%±4.36%;1‰DMSO組24h及48 h愈合率分別為38.12%±3.86%、56.52%±4.68%;40uM組處理24 h后愈合率為28.64%±

8、3.15%、處理48 h愈合率為39.72%±4.11%;80uM組處理24 h愈合率為21.11%±4.18%、處理48 h愈合率為30.81%±3.74%。TCP處理786-O細胞后,細胞的遷移能力明顯低于0uM組和1‰DMSO組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0uM組和1‰DMSO組比較,遷移力無明顯差異(P>0.05)。表明TCP處理后786-O細胞遷移能力明顯下降,且與時間和濃度呈正相關,1‰DMSO對786-O細胞的遷移

9、力無影響;
　　6、應用Transwell小室檢測TCP對腎癌786-O細胞侵襲能力的影響,TCP以40、80uM作用腎癌786-O細胞24h,對照組(0uM組、1‰DMSO組)亦作用24h。結果發(fā)現0uM組、1‰DMSO組兩兩比較,侵襲到平鋪基質膠的Transwell小室下室面的細胞數無明顯差異,分別為286.25±25.81和294.82±24.36,說明1‰DMSO對768-O細胞的侵襲能力無明顯影響;40uM和80uM組侵

10、襲到小室下室面的細胞數分別為195.86±19.43和115.76±18.56,表明隨濃度的增高,穿過Transwell小室膜的細胞數逐漸減少,細胞的侵襲力逐漸下降(P<0.05)。與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。說明TCP對786-O細胞侵襲數目的抑制呈濃度依賴性。
　　結論:
　　1、LSDl抑制劑TCP在體外可以抑制腎透明細胞癌786-O細胞的增殖,且呈濃度-時間依賴性;
　　2、TCP可以誘導體外培