基于RARα-HDAC雙靶點(diǎn)抗癌藥物的設(shè)計(jì)、合成與生物活性研究.pdf

1、1.立題背景
　　 長(zhǎng)期以來(lái)，白血病一直是威脅人類生命健康的惡性血液疾病，并且隨著工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展、環(huán)境的惡化，誘發(fā)白血病的外因逐漸增多，使得白血病的發(fā)病率特別是兒童白血病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。
　　 隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，白血病的發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，染色體易位、原癌基因及抑癌基因的變異是白血病發(fā)病的主要原因，信號(hào)通路等的改變對(duì)白血病的進(jìn)程有直接的影響，但由于不同類型的白血病發(fā)病機(jī)制的差異，造成白血病治療的復(fù)

2、雜性及多變性。
　　 維甲酸類化合物是4000余個(gè)天然及合成化合物的總稱，其中多種化合物已成為腫瘤治療的一線用藥，如全反式維甲酸(ATRA)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用而成為復(fù)發(fā)或難治性急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)治療的首選及一線用藥;他米巴羅汀(Tamibarotene，AM80)，是特異性RARα激動(dòng)劑，臨床主要用于治療各種類型的APL，由日本NipponShinyaku公司開(kāi)發(fā)，2005年6月在日本首次上市(商品名:Amnola

3、ke)。
　　 組蛋白去乙酰化酶(HDAC)通過(guò)參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而與白血病及其它惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療中一類較新的作用靶點(diǎn):通過(guò)核受體，HDAC可被募集至腫瘤細(xì)胞中，使腫瘤細(xì)胞中HDAC呈高表達(dá)，其后果包括:細(xì)胞中基因的正常轉(zhuǎn)錄因此受到抑制，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生;其次，白血病及其它惡性腫瘤中往往存在細(xì)胞的異常增殖及分化受阻，這與影響細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的相關(guān)蛋白的靜默相關(guān)，而這些蛋白的靜默是啟動(dòng)子區(qū)域DNA的異常甲基化

4、，以及包含組蛋白去乙?；趦?nèi)的染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的結(jié)果。這種HDAC與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展間的相關(guān)性是尋找及研究組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)的理論基礎(chǔ)。組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)共分6大類，目前已有部分組蛋白去乙酰化酶抑制劑被批準(zhǔn)上市，還有10多個(gè)處于臨床試驗(yàn)階段。組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠緩解特定致癌基因產(chǎn)物引起的轉(zhuǎn)錄抑制，已證實(shí)在白血病及其它惡性腫瘤的治療中具有確切的療效，其對(duì)白血病的治療機(jī)制主要包括:

5、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，特別是對(duì)ATRA產(chǎn)生耐藥的病人尤其顯著:HDACIs通過(guò)抑制HDAC活性，消除特定靶細(xì)胞組蛋白去乙酰化，使得白血病細(xì)胞恢復(fù)對(duì)ATRA的敏感性;其它作用機(jī)制還包括誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡及抑制增殖;細(xì)胞周期阻滯等等。組蛋白去乙?；敢种苿┑膬?yōu)點(diǎn)在于，靶向性較好，相應(yīng)地毒副作用較小，缺點(diǎn)是生物利用度低、代謝快。目前已有多個(gè)HDACIs進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，SAHA是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)上市的HDACIs。
　　 2.目標(biāo)化合物的

6、設(shè)計(jì)
　　 對(duì)已有的HDACIs結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HDACIs的結(jié)構(gòu)一般由三部分組成:疏水性基團(tuán)、連接基團(tuán)及鋅離子螯合基團(tuán)?；谝阎狧DAC抑制劑（如SAHA）的三維結(jié)構(gòu)及其與酶的結(jié)合模型，根據(jù)藥物設(shè)計(jì)的拼合原理，同時(shí)借鑒前藥及多靶點(diǎn)藥物理論，本文以RARα選擇性激動(dòng)劑他米巴羅汀(AM80)為疏水性基團(tuán)，以異羥肟酸、羧基等作為鋅離子螯合基團(tuán)，通過(guò)酯鍵或酰胺鍵（連接基團(tuán)）將二者融合，設(shè)計(jì)合成了一系列結(jié)構(gòu)全新的HDAC抑制劑。目標(biāo)化

7、合物進(jìn)入到體內(nèi)后，通過(guò)抑制HDAC的活性，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其分化和誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)，其在體內(nèi)酯酶或酰胺酶催化下可代謝釋放出AM80，AM80作用于RARα受體而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化和抑制其增殖而發(fā)揮白血病治療作用，實(shí)現(xiàn)與前體藥物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。
　　 3.目標(biāo)化合物的合成
　　 本研究以2，5-二甲基-2，5-己二醇為起始原料，經(jīng)過(guò)鹵代、付-克烷基化、硝化、催化氫化、?；?、縮合反應(yīng)，然后經(jīng)酯水解反應(yīng)得到關(guān)鍵

8、中間體他米巴羅汀(AM80)。最后他米巴羅汀與鄰苯二胺，鹽酸羥胺，羥基乙酸，甘氨酸等進(jìn)行近一步的縮合得到目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物和具有全新結(jié)構(gòu)的中間體化合物采用H-NMR、ESI-MS譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。
　　 4.目標(biāo)化合物生物活性評(píng)價(jià)
　　 對(duì)所合成化合物進(jìn)行了體外的初步活性評(píng)價(jià)。體外抑酶試驗(yàn)中，采用HDAC（HDAC試劑盒、Hela細(xì)胞提取物和HDAC-8）、氨肽酶-N和明膠酶三種酶分別進(jìn)行活性篩選。驗(yàn)結(jié)果表明所有的目

9、標(biāo)化合物對(duì)HDAC有選擇性抑制作用，其中化合物10b和12b對(duì)HDAC的抑酶活性與陽(yáng)性對(duì)照SAHA相當(dāng)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法測(cè)定了化合物10b和12b對(duì)人卵巢透明細(xì)胞癌ES-2，人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562，人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60和NB4以及人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3的增殖抑制活性。結(jié)果表明化合物10b和12b對(duì)ES-2細(xì)胞、PC-3細(xì)胞、K562細(xì)胞及H

10、L-60細(xì)胞的抑制活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照SAHA，對(duì)HCT116細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞及NB4細(xì)胞的抑制活性均略弱于陽(yáng)性對(duì)照SAHA。10b對(duì)HL-60及NB4細(xì)胞的抑制活性明顯優(yōu)于對(duì)照組AM80，12b對(duì)NB4細(xì)胞的抑制活性亦明顯優(yōu)于AM80。
　　 5.藥動(dòng)學(xué)研究
　　 選取具有較好抑酶活性和增殖抑制活性的目標(biāo)化合物12b和10b，以已批準(zhǔn)上市的RARα受體選擇性激動(dòng)劑AM80為陽(yáng)性對(duì)照藥，采用口服和靜脈注射兩種

11、給藥途徑研究了目標(biāo)化合物在Wistar大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特性。結(jié)果顯示，靜注給藥后，10b在血漿中以獨(dú)立分子存在，5min至11h可持續(xù)釋放出AM80，并且10b作為AM80的前體藥物，與AM80單獨(dú)給藥相比，各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均有較大改變，如使AM80的MRT從4.44h延長(zhǎng)到18.09h，t1/2從2.22h延長(zhǎng)到3.88h，Tmax也從0.08h延長(zhǎng)到4h，這些結(jié)果顯示10b靜注可以很好地和其前體藥物發(fā)揮協(xié)同治療作用。與靜注給藥相比，

12、10b和12b口服給藥均顯示較低的生物利用度，血漿中僅檢測(cè)到少量的前體藥物及AM80。
　　 6.總結(jié)與展望
　　 本研究以他米巴羅汀為基本結(jié)構(gòu)骨架設(shè)計(jì)合成了19個(gè)目標(biāo)化合物，并對(duì)其進(jìn)行了體外初步活性評(píng)價(jià)。其中，化合物10b和12b在體外表現(xiàn)出較好的抑酶活性及對(duì)多株腫瘤細(xì)胞很強(qiáng)的增殖抑制活性。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明目標(biāo)化合物可代謝釋放出AM80，與其前體藥物HDAC抑制劑形成協(xié)同治療、調(diào)節(jié)作用，使其具有多靶點(diǎn)效應(yīng)。這些化