靶向TGF-βⅡ型受體胞外段核酸適配子S58結(jié)構(gòu)優(yōu)化篩選及結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測研究.pdf

1、研究背景:
　　青光眼濾過手術(shù)是目前治療青光眼最重要的方法,但是手術(shù)失敗的主要原因是手術(shù)后濾過泡的瘢痕纖維化。臨床上往往術(shù)中使用5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)等抗代謝藥物來抑制術(shù)后濾過泡的疤痕形成,以提高手術(shù)成功率,但仍然有諸如濾過泡滲漏、低眼壓、眼內(nèi)炎、角膜損傷等并發(fā)癥的發(fā)生。因此,尋求一種更為安全、有效、毒性小的藥物作用于抗青光眼術(shù)后抑制瘢痕形成是目前的研究熱點(diǎn)。濾過泡的瘢痕化與多種致纖維化因子的活性密切相關(guān),其

2、中轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的作用至關(guān)重要,其亞型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的發(fā)生中起主要作用。TGF-β與其Ⅱ型受體(TGF-β receptorⅡ,TβRⅡ)結(jié)合作為致組織纖維化的啟動(dòng)環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵步驟,促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞,合成大量的細(xì)胞外基質(zhì),在組織瘢痕化的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。因此,通過拮抗或者封阻TGF-β與TβRⅡ的結(jié)合,可以作為青光

3、眼術(shù)后抗瘢痕治療新的研究途徑。
　　本課題組在前期的研究中使用SELEX技術(shù)篩選得到了靶向TβRⅡ胞外段的核酸適配子S58,并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證 S58能有效抑制人成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá),且能明顯阻抑TGF-β2介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞收縮作用。初步篩選出來的核酸適配子一般作為先導(dǎo)分子,需要進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化或者基團(tuán)修飾,尋找到能發(fā)揮功能的最佳序列。大多數(shù)適配子的兩端序列是固定側(cè)翼序列,對其功能影響較微弱,核酸適配子S58是含

4、60個(gè)左右堿基的核酸,其合成成本較高,因此本研究將S58進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,分別從兩端逐步剪切縮短序列,去掉冗余的序列,得出新的較短適配子DNA,并在體外分別驗(yàn)證核酸適配子58及優(yōu)化后ssDNA的結(jié)合力情況,從細(xì)胞水平驗(yàn)證其生物學(xué)效應(yīng),從中篩選出發(fā)揮最佳效果的最短適配子序列,為青光眼術(shù)后抗瘢痕治療尋找到新的替代藥物,并為下一步藥效動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供的理論基礎(chǔ)。
　　適配子能發(fā)揮作用是基于其能識別靶分子上不同的基團(tuán),并自身發(fā)生適應(yīng)性

5、結(jié)構(gòu)改變使其能與靶分子緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),故常常具有與抗體相似甚至更高的親和力、特異性。因此研究適配子的作用機(jī)制重點(diǎn)在于研究其空間結(jié)構(gòu)及與靶分子的結(jié)合位點(diǎn)。伴隨分子生物學(xué)和信息科學(xué)飛速的發(fā)展,利用生物信息學(xué)方法探索蛋白質(zhì)與核酸相互作用能提高其有效性,縮短研究工作的時(shí)間,達(dá)到事半功倍的效果,生物信息學(xué)已經(jīng)成為研究生物領(lǐng)域課題的一項(xiàng)指導(dǎo)科學(xué)。因此運(yùn)用生物信息學(xué)方法建立篩選出的最佳核酸適配子的三維模型,研究其與受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是尤為

6、必要并且可行的,旨在初步探索最佳核酸適配子發(fā)揮體外生物高效應(yīng)的作用機(jī)理。
　　目的:
　　本研究擬將根據(jù)靶向TβR胞外段核酸適配子S58序列進(jìn)行剪切縮短,合成新的較短適配子DNA,并在體外進(jìn)行其結(jié)合力、生物學(xué)效應(yīng)的驗(yàn)證研究,篩選出發(fā)揮最佳生物功能的適配子,為抗青光眼術(shù)后抗瘢痕治療提供新的思路。進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)建立適配子的三維模型,并預(yù)測其與受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn),對最佳適配子發(fā)揮體外作用的機(jī)理進(jìn)行初步研究。
　　方法:

7、
　　1.激光共聚焦顯微鏡觀察核酸適配子S58與成纖維細(xì)胞的結(jié)合情況,根據(jù)核酸適配子S58序列從兩端逐步剪切縮短,每次剪切掉5bp,得到7個(gè)新的較短適配子ssDNA,運(yùn)用生物傳感器芯片包被受體蛋白后分別檢測核酸適配子S58及結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的ssDNA的親和力大小。流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測熒光標(biāo)記后的核酸適配子S58及結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的ssDNA與HTFs的結(jié)合率情況。從而篩選出結(jié)合力最強(qiáng)的適配子。
　　2.核酸適配子S58及結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的ss

8、DNA與TGF-β一同作用于HTFs24小時(shí)后運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞的α-SMA的表達(dá)量,核酸適配子 S58及結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的ssDNA與TGF-β共同作用48h后檢查成纖維細(xì)胞凝膠的收縮情況。從而篩選出體外生物學(xué)效應(yīng)最佳的適配子。
　　3.通過核酸適配子序列轉(zhuǎn)錄為RNA序列,運(yùn)用軟件建立其RNA的三維模型,再轉(zhuǎn)換為ssDNA的三維模型,Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫搜索到受體蛋白TβRII胞外段的晶體結(jié)構(gòu),比對

9、確認(rèn)最有可能在溶液中與適配子結(jié)合的三維晶體結(jié)構(gòu),然后對DNA分子和蛋白質(zhì)分子進(jìn)行半柔性分子對接實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)聚類分析核酸適配子的結(jié)合情況,根據(jù)函數(shù)打分及經(jīng)驗(yàn)選擇出最可靠的核酸適配子與受體胞外段蛋白的復(fù)合物模型,運(yùn)用軟件準(zhǔn)確分析其結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1.激光共聚焦顯微鏡下能夠觀察到5’端標(biāo)記的FITC-S58熒光顯示與HTFs排列形態(tài)一致;在相同濃度下,S58與TβRⅡ的結(jié)合反應(yīng)峰值維持在350arc/s,其次為S583’

10、端剪切5bp結(jié)合反應(yīng)峰值達(dá)200arc/s,S583’端剪切10bp結(jié)合反應(yīng)峰值達(dá)160arc/s, S583’端剪切15bp僅為130 arc/s,S585’端剪切的結(jié)合反應(yīng)峰值均僅達(dá)80~120arc/s。相同濃度為5nmol/L時(shí),FITC-58與HTFs的結(jié)合率為72.9％,而5’端剪切的ssDNA S58-1~4的細(xì)胞結(jié)合率分別為:39.0%、27.6%、23.5%、22.3%,3’端剪切的ssDNA S58-5~7的細(xì)胞結(jié)合

11、率分別為:41.4%、38.7%、23.9%。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示所有剪切縮短的ssDNA組中只有TGF-β2+S583’-5bp組較TGF-β2組α-SMA表達(dá)有明顯降低(P=0.000),但其降低程度仍比TGF-β2+S58組低,其他組與TGF-β2組比較α-SMA表達(dá)均無差異(P>0.05)。細(xì)胞收縮實(shí)驗(yàn)中TGF-β2組刺激后HTFs收縮后是原面積的11.6%,TGF-β2+S58組刺激后HTFs收縮后

12、是原面積的63.2%,與 TGF-β2組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而TGF-β2+S585’-5bp組及TGF-β2+S583’-5bp組刺激后HTFs收縮后是原面積的9.7%、10.4%,與TGF-β2組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　3.TβRII胞外段蛋白由122個(gè)氨基酸組成,有10種自然態(tài)結(jié)構(gòu),并且是以二聚體結(jié)構(gòu)存在,最有可能在溶液中與適配子結(jié)合的三維晶體結(jié)構(gòu)是1PLO-3。核酸適配子S58是60個(gè)堿基的

13、寡核苷酸,形成三維結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)生自身適應(yīng)性互補(bǔ)形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu),聚類分析找出DNA與受體蛋白的結(jié)合面。根據(jù)對接后函數(shù)打分找到最可能的復(fù)合物模型,再分析其結(jié)合位點(diǎn)分別包括位點(diǎn)I(T4、T5、G6、C7)、位點(diǎn)II(G13、A14、T15、C16、G17、C18)、位點(diǎn)III(T31、G32、T33、C34)及位點(diǎn)IV(G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46號)。
　　結(jié)論:
　　1.剪切后的ssDNA中S58-5

14、即S583’端剪切5bp與TβRⅡ結(jié)合力最強(qiáng),但仍較S58降低。同樣剪切后的ssDNA與HTFs的結(jié)合率也較S58降低。因此,核酸適配子S58的結(jié)合力仍是最佳的,5’端及3’端剪切后得到的新ssDNA結(jié)合力均較S58均下降,并且剪切堿基越多,結(jié)合力越低。
　　2.體外核酸適配子S58能抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs轉(zhuǎn)分化、收縮作用,剪切縮短后的ssDNA中只有S583’端剪切5bp對TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs轉(zhuǎn)分化有一定抑制作用,

15、但作用比S58弱,其他縮短后的ssDNA均無明顯作用,并且剪切堿基越多,作用越弱。因此核酸適配子S58的生物學(xué)效應(yīng)仍是最佳的,5’端及3’端剪切都會(huì)影響其生物功能。
　　3.核酸適配子S58與TβRⅡ胞外段的結(jié)合位點(diǎn)較緊密。5’端剪切5bp就會(huì)剪切掉結(jié)合位點(diǎn)I(T4、T5、G6、C7)中的T4,同樣,5’端剪切10bp、15bp、20bp還影響到位點(diǎn)II(G13、A14、T15、C16、G17、C18),因此5’端剪切會(huì)顯著影響適