SELEX技術(shù)篩選人TGF-βRⅡ親和核酸庫方法的建立.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文SELEX技術(shù)篩選人TGFβRⅡ親和核酸庫方法的建立姓名：劉曉靜申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（野戰(zhàn)外）指導(dǎo)教師：朱旭東20040501第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文7為1.21015。靶蛋白TGFβRⅡ與ssDNA0溫育后，反應(yīng)混合液上樣到硝酸纖維素膜上，真空抽濾，洗脫游離核酸。7M尿素、酚氯仿回收膜上滯留的ssDNA。行PCR擴(kuò)增時(shí)，采用5′端生物素化的下游引物，使PCR產(chǎn)物偶聯(lián)上生物素。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化

2、PCR產(chǎn)物。利用StreptavidinAgarose捕獲dsDNA，0.15N的NaOH使雙鏈變性，釋放非生物素標(biāo)記的ssDNA，回收后用于第2輪篩選。2)第2～4輪篩選：將靶蛋白TGFβRⅡ預(yù)先吸附到固相基質(zhì)PhenylAgarose上，然后與ssDNA富集庫溫育，洗脫未結(jié)合核酸，回收與TGFβRⅡ結(jié)合的ssDNA。擴(kuò)增、富集、分離目的ssDNA步驟同前。從第3輪篩選始，引入針對固相基質(zhì)PhenylAgarose的反向篩選。3)第5

3、～8輪篩選：與第3～4輪篩選相比，做兩點(diǎn)調(diào)整：(1)反向篩選調(diào)整為：富集庫與預(yù)先吸附了BSA的固相基質(zhì)PhenylAgarose溫育。(2)篩選時(shí)，向篩選緩沖體系中加入酵母tRNA。隨著篩選的進(jìn)行，嚴(yán)謹(jǐn)度不斷增加。3.監(jiān)測富集庫進(jìn)化狀態(tài)1)膜結(jié)合測定實(shí)驗(yàn)：將32P放射性標(biāo)記的初始庫、富集庫分別與TGFβRⅡ及BSA溫育，反應(yīng)混合液上樣到硝酸纖維素膜上，負(fù)壓抽濾，空氣中干燥濾膜。液閃儀計(jì)數(shù)CPM值。以百分值〔(核酸蛋白組膜上放射殘留量－單

4、純核酸組膜上放射殘留量)投入反應(yīng)核酸的放射總量〕100％估算核酸庫對靶蛋白的親和程度。2)凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)：將32P放射性標(biāo)記的初始庫、富集庫分別與TGFβRⅡ及BSA溫育，反應(yīng)混合液上樣到4％非變性聚丙烯酰胺凝膠中，電泳，放射自顯影。結(jié)果：第8輪富集庫對靶蛋白TGFβRⅡ的親和力較初始隨機(jī)庫提高了22.61倍，有非常顯著的差異(P0.01)。在第8輪富集庫＋TGFβRⅡ組泳道中觀察到核酸蛋白復(fù)合物滯后帶。同時(shí)，雖然第8輪富集庫對BSA