篩選環(huán)孢霉素A適體的Bio Mag-SELEX方法的建立.pdf

1、環(huán)孢霉素A(cyclosporinA,CsA)屬真菌來源，是含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，具有較強的細胞免疫抑制作用，能有效地防止移植后的排斥反應，延長腎臟、肝臟、心臟等同種異體移植器官和組織的存活。同時，CsA及其代謝產物具有嚴重的毒副作用，主要是腎毒性和肝毒性等，故定期監(jiān)測病人血液中CsA的濃度至關重要。 SELEX技術即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialE

2、nrichment,SELEX)技術，是一種新型的體外篩選技術。適體(aptamer)，又稱適配分子或適配子，其實質是運用SELEX技術從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結合的一段寡核苷酸序列。 適體的功能類似于抗體但明顯優(yōu)于抗體，具有靶分子范圍廣泛、親和力和特異性高、制備方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在臨床治療和診斷方法等方面都具有廣闊的應用前景。本研究旨在運用SELEX技術從人工體外合

3、成的隨機ssDNA文庫中篩選到針對CsA的特異性適體，為建立檢測全血CsA濃度的快速而簡便的實驗室方法奠定基礎。 我們先將CsA共價結合到甲苯磺?；罨胖樯稀ｓw外合成一個全長78個核苷酸中間含35個隨機序列的隨機ssDNA文庫，以連接在磁珠上的CsA為靶分子，通過BioMag-SELEX方法篩選CsA特異性適體，利用生物素-鏈親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測每輪ssDNA文庫與CsA的親和力，將最后一輪篩選產物克隆測序并運用相關

4、軟件進行適體序列一級結構和二級結構分析。 經(jīng)過10輪的篩選和擴增，得到了CsA特異性的適體，每輪ssDNA文庫與CsA的親和力呈上升趨勢。19個克隆適體序列全長78nt，根據(jù)一級結構序列的同源性可分為5個家族，家族3有完全相同的15條適體序列，這些序列將是我們今后研究的重點。二級結構預測以莖環(huán)(發(fā)夾)結構為主，這可能是適體與靶分子作用的結構基礎。CsA特異性的適體的篩選為我們今后建立相關的酶聯(lián)寡核苷酸試驗(ELOSA)等檢測方法