體外SELEX技術(shù)篩選沙門氏菌O8適體的方法學(xué)研究及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：本論文旨在運(yùn)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，從體外構(gòu)建一個(gè)總長78nt中間隨機(jī)序列包括35 nt的ssDNA文庫中篩選出針對(duì)沙門氏菌O8的一組高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，為致病微生物的快速檢測提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　(1)以沙門氏菌O8為靶分子，體外構(gòu)建總長78 nt，兩端為固定序列，中間隨機(jī)區(qū)為35nt的ssDNA文庫，經(jīng)過九輪的SELEX篩選，篩選出針對(duì)沙門氏菌O8高親和力、

2、高特異性的適體群，并在第四輪和第七輪分別用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行反篩，以提高篩選的特異性。運(yùn)用地高辛一抗地高辛抗體-堿性磷酸酶系統(tǒng)檢測各輪篩選產(chǎn)物與沙門氏菌O8的結(jié)合率。
　　(2)將第九輪的篩選產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、純化，克隆、測序，并用Clustal W、RNA Structure、MEGA4和DNA MAN軟件分析一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性并進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。
　　(3)克隆菌質(zhì)粒抽提，測定其與沙門氏菌O8的結(jié)合率，選出結(jié)合最高

3、的2條克隆適體，通過比較Kd值和特異性檢測，最終得出一條最佳克隆適體。
　　(4)用熒光基團(tuán)FAM和TAMRA標(biāo)記最佳克隆適體，直接和沙門氏菌O8、反篩菌結(jié)合，洗滌、封片，熒光顯微鏡觀察，初步建立熒光基團(tuán)標(biāo)記適體快速鑒定沙門氏菌O8的檢測方法。
　　結(jié)果：
　　(1)篩選產(chǎn)物與沙門氏菌O8的吸光度值從首輪的0.20最終上升到0.89，為首輪的4.45倍，說明SELEX篩選輪數(shù)的增加使ssDNA富集庫與沙門氏菌O8的親和

4、力顯著增加，但最后兩輪的吸光度值差別不大，說明ssDNA富集庫與沙門氏菌O8上的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，寡核苷酸不再吸附到菌體上。
　　(2)挑選22個(gè)隨機(jī)克隆子測序結(jié)果：按堿基長短是否與預(yù)期片段長度相同可分為A、B、C三組，A組為19條與預(yù)期片段長度相同的適體序列，其中適體堿基序列完全相同的有2對(duì)，同源性最高可達(dá)100%；B組為2條中間隨機(jī)區(qū)缺失1個(gè)堿基的適體序列；C組為1條中間隨機(jī)區(qū)增加3個(gè)堿基的適體序列。通過系統(tǒng)發(fā)育樹圖可知，大部

5、分序列的同源性保持在70%以上，最高可達(dá)100%。通過RNA Structure軟件預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。
　　(3)克隆適體B10、G05與沙門氏菌O8結(jié)合的吸光度值明顯增加；飽和力測定結(jié)果可知，B10的Kd值為32.04 nM，G05的Kd值為175.9 nM，Kd值越低，適體的親和力越高，得出B10為最佳適體；將B10適體進(jìn)行特異性檢測，沙門氏菌O8與B10適體結(jié)合的吸光度值達(dá)到0.863，而大腸桿菌、豬霍亂沙

6、門氏菌分別為0.251和0.375。
　　(4)熒光顯微鏡下直接觀察熒光基團(tuán)5’-FAM和5’-TAMRA標(biāo)記克隆適體B10與沙門氏菌O8、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌的結(jié)合，可見B10適體明顯結(jié)合到了沙門氏菌O8上，菌體上出現(xiàn)了較強(qiáng)的綠色和橘紅色熒光，而與大腸桿菌和豬霍亂沙門氏菌僅存在極少量的結(jié)合；熒光標(biāo)記適體檢測沙門氏菌O8的靈敏度可達(dá)102/ml。
　　結(jié)論：本論文以沙門氏菌O8為靶分子，利用SELEX篩選技術(shù)，經(jīng)九輪篩選